196227. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új ciklikus, vazopresszin antagonista peptidek és az ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
196227 2 1 „ két kvalitatív ninhidrin-próbákkal ellenőrizzük, és a kapcsolást szükség esetén megismételjük. A Boc-csoportokat trifluor-ecetsav/metilén-klorid 1:1 arányú elegye segítségével távolltjuk el, és mosás után a szabad amint 5% diizopropil-etil-amint tartalmazó mctilén-kloriddal szabadítjuk fel. A pepiid szekvenciáját szilárd fázisú módszerrel ellenőrizzük mielőtt a 4-MeBzl-Pmp-t hozzákapcsoljuk és homogenitásáról mégbizonyosodunk. Az utolsó kapcsolás után a gyantát raegszáritva 2,24 g gyantához kötött peptidet kapunk a Pmp(4-MeBzl)-D-Tyr(Et)-Phe-Val-Asn-Cy$(4-MeBzl)-Pro-OH vegyület esetén. A hordozóhoz kötött fenti peptid 1,1 g-ját (0,5 millimól) 3 ml anizollal keverjük 60 percen keresztül 0 °C hőmérsékleten (jégfürdőn) 25 ml hidrogén-fluoridbán. A hidrogén-fluoridot 0 °C hőmérsékleten vákuumban lepároljuk. A maradékot négyszer 20 ml etil-éterrel mossuk, és a peptidet háromszor 10 ml dimetil-formamiddal, háromszor 10 ml 20%-ós ecetsavval és háromszor 10 ml 0,3 n ammónium-hidroxiddal eluáljuk. A szűrletet 2 1 gázmentesitett vízhez adjuk és a pH-t 7,1-re állítjuk be koncentrált ammónium-hidroxid segítségével. Ezután kálium-(hexaciano-ferrát) 0,Ö1 mól/1 oldatát adjuk hozzá addig, amíg a sárga szín állandósul (41 ml). Ezt az oldatot ecetsavval PH = 4,7-re savanyítjuk és egy éjszakán át hűvös helyen tároljuk. Az oldat pH-ját ammóniával 7-re állítjuk és 15 percen keresztül 30 g Bio-Rad AG—-3 x 4 nedves, > Cl- formában lévő ioncserélő gyantával keverjük. Ezután ezt az oldatot lassan keresztülszűrjük további 30 g gyantán. A gyantát kétszer 400 ml 20%os ecetsavval mossuk, és a szűrletet hűvös helyen egy éjszakán át tároljuk. A szűríetet Baker C-18 márkanevű szilánnal bevont szílikagél töltetet tartalmazó flash oszlopon (5 cmx 10 cm) vezetjük keresztül. Az oszlopot ezután 350 ml vízzel mossuk és a peptidet 500 ml, 0,25% trifluor-ecetsavat tartalmazó acetonitril/víz 1:1 arányú elegyével eluáljuk úgy, hogy 20 ml-es frakciókat engedünk rá az oszlopra. A 11—17. frakciót egyesítjük és bepároljuk. A maradékot koncentrált ecetsavban oldjuk, vízzel hígítjuk és liofilizáljuk, így 189 mg Pmp-D-Tyr(Et>----------------------------------------,-Phe-Val-Asn-Cys-Pro-OH peptidet kapunk, melyet további tisztítás nélkül használunk fel a láncvégen módosított peptidek szintézisében. A Pmjp-D-Tyr(Et)-Phe- Val-Asn-Cys-Pro-OH analízise Aminosav analízis: Peptidtartalom: 55%. Asp: 1,00; Val: 1,04; Pro: 1,23; Tyr(Et): 1,43; Cys: 0,35; Phe: 1,51. HPLC: kielégítő. A Pmp-D-Tyr-Phe- Vat-Asn-Cys-Pro - OH analízise Aminosav analízis: Peptidtartalom: 82% Asp: 0,97; Val: 1,05; Pro: 1,10; Tyr: 0,99; Cys: 0,39; Phe: 0,99. HPLC: kielégítő. (30% CHjCN/70% 0,05 M KH2P04; 2 ml/ perc; SuC-18, k' =6,14) 10 mg, az előzőekben ismertetett módon előállított Pmp-D-Tyr(Et)-Phe-Val-Asn-Cys-Pro-OH és 1 ml metanol keverékét éteres diazo-metánnal kezeljük, majd preparativ HPLC-vel (eluens: 50% CHn CN/50% HjO/0,1% TFA) tisztítjuk, így 7,5 mg (74%) metil-észtert kapunk. F AB—MS:m/z 938 (M + H)+ HPLC-vel és TLC-vel vizsgálva homogén. 29,7 mg. az előzőekben ismertetett módon előállított (0,0331 millimól) Pmp-D-Tyr(Et)-Phe-VaI-Asn-"Cys-Pro-OH heptapeptidet és 0,0996 millimól ArgíNHiH 400 ul dimetil-formamidban oldunk, 10,3 mg (0,05 millimól) diciklohexil-karbodiimidet és 0,05 millimól dimetil-amino-piridint adunk hozzá, máld a reakcióelegyet 0—20 °C hőmérsékleten 4 órán keresztül keverjük. A dimetil-formamidot ezután^ vákuumban eltávolítjuk. A maradékot a 3. példában leírt módon kezeljük, így a kívánt Pmp-t)-Tyr(Et)-Phe-Val-Asn-Cys-Pro-Arg-NH2-t 45%os kitermeléssel kapjuk. 12. példa A Pmp-D- Tyr(Et)-Phe- Val-Asn Cys-Pro-D-Arg-NHi szintézise A BHA-gyantához kötött Pmp(S-MeBzl)-D-Tyr (Et)-Phe-Val-Asn-Cys(S-MeBzl)-Pro-D-Arg(Tos) lineáris peptidet szilárd fázisú módszerrel állítunk elő, mint azt a fentiekben ismertettük. így 1,0 millimól aminnak megfelelő 1,5 g benzhidril-amin-gyantát kapcsolunk egymás után a Boc-vel védett, háromszoros fölöslegben lévő aminosav-származékokhoz metilén-klorid és dimetil-formamid 1:1 arányú elegyében oldott DCC-t és HOB-t használva. A Pmp(S-MeBzl)-t DCC/DMAP segítségével kapcsoljuk. A kapcsolási reakció teljessé válását Kaiser-próbával vagy kvantitatív ninhidrin-próbával ellenőrizzük. A kapcsolást újból elvégezzük, ha a próba negatív. A hordozóhoz kapcsolt, védett peptidet egymás után metilén-kloriddal, metanollal, etil-acetáttal és metilén-kloríddal mossuk, majd a levegőn megszárítjuk. A pe étidet 15 ml folyékony hidrogén-fluorid segítségével hasítjuk le a gyantáról 1 ml anizol jelenlétében 0 °C nőmérsékleten 1 órán keresztül. A hidrogén-fluorid lehajtása és nagy vákuumban való szárítás után a gyantát háromszor 20 mi éterrel mossuk, majd kétszer 50 ml 50%-os ecetsavval, 50 ml 10%-os ecetsavval és 50 ml vízzel extraháljuk, Az egyesített extraktumokat vízzel 41-re hígit-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
