196227. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új ciklikus, vazopresszin antagonista peptidek és az ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 196227 2 , 9. példa A Pmp-D-Tyr(Et)-Phe-Chg-Asn-Cps-Pro-Arg-NHi szintézise A 8. példa szerint előállított hordozón lévő pepiid egy részéhez további, Boc csoporttal védett, 1,5 millimól mennyiségű aminosavakat majd béta-(S-4-MeBzl)-Pmp-OH-t kapcsolunk a megfelelő sorrendben, így 1,06 g MBHA-gyantához kötött, védett Pmp(S-4-MeBzl)-D-Tyr(Et)-Phe-Chg-Asn- Cys(S-4-MeBzl)-Pro-Arg-(Tos) pepiidet kapunk vákuumban való szárítás után. Ezt a gyantához kötött pepiidet 1,5 ml anizollal és 25 ml vízmentes hidrogén-fluoriddal kezeljük. Kálium-(hexaciano-ferrát)-tal való oxidáció és a termék Boker C!8oszlopon való elválasztása után 165 mg nyers, cím szerinti terméket kapunk. További CCD, Sephadex G—15 és Bio Red P—2 gélszűrés — melyeket a fentiekben már ismertettünk — 55 mg, nagynyomású folyadékkromatográfiásán (HPLC) tiszta cím szerinti terméket eredményez. Peptidtartalom: 88% FAB/MS: m/z 1119 (M + H)+ 10. példa A Pmp-D- Tyr(Et)-Phe- Val-Asn-Cys-OH előállítása és a 3. példa szerinti termék előállításához való felhasználása 4,87 g (15 millimól) Boc-Cys(4-MeBzl)-t 30 ml etanolban oldunk, majd 10 ml vizet adunk hozzá. A pH-t cézium-bikarbonát vizes oldatának hozzáadásával 7,1-re állítjuk be. Az elegyet bepároljuk, és a maradékot háromszor 50 ml toluolból ismételten bepároljuk. Ezt a maradékot nagy vákuum alatt szobahőmérsékleten tartjuk egy éjszakán keresztül. A sót 35 ml dimetil-formamidban oldjuk, majd 5 g kereskedelmi klór-metil-fenil-gyantát adunk hozzá. A kapott elegyet 53 °C hőmérsékleten argon atmoszférában egy éjszakán át keverjük. Az elegyet leszűrjük és a gyantát 5 x 60 ml dimetil-formamiddal, 5x60 ml dimetii-formamid/víz 9:1 arányú elegyével, 5 x60 ml dimetil-formamiddal és 6 x 60 ml etanollal mossuk. Ezután nagy vákuum alatt, szobahőmérsékleten a hétvégén szárítjuk. A peptid láncot egy Beckman szintetizátorban a fentiekben leírt módon építjük fel Asn, Val, Phe, D-Tyr(Et) Boc-vel védett, Pmp S-(4-MeBzl)-lel védett származékát használva. A gyantát a szintetizátorból eltávolítjuk és egy kézi rázó tölcsérbe helyezzük. 0,86 g tömegű, gyantához kötött pepiidet 1,5 ml anizollal kezelünk és 60 percen keresztül 0 °C hőmérsékleten 15 ml hidrogén-fluoriddal kevertetjük. A hidrogén-fluoridot ezután 0 °C-on eltávolítjuk. A maradékot ezután háromszor 25 ml éterrel mossuk és a pepiidet dimetil-formamidos 30%-os ecetsavba (4x 10 ml) oldjuk át. Ezt az oldatot 2 1 gázmentesített vízhez adjuk, és a pH-t ammónium-hidroxiddal 7,0-re állítjuk be, majd 35 ml 0,01 mól/1 kálium-(hexaciano-ferrát) oldatot adunk hozzá lassan. Ezután a pH-t 4,5-re állítjuk be ecetsavval és az elegyet 30 percig 25 g gyengén bázikus ioncserélő gyantával (WET) (Dowex AG-3x4 1R-4S) együtt kevertetjük. A szuszpenziót leszűrjük és a gyantát 2x400 ml 30%-os ecetsavval mossuk. A szűrletet egy Ci8 flash oszlopon (7 x 16 mm) vezetjük keresztül. Az oszlopot 3x400 ml vízzel mossuk, és a peptidet acetonitril/víz/TFA 50: :50:0,25 arányú elegyével eluáljuk. A 30—36. frakciókat egyesítjük, koncentráljuk és liofilizáljuk, így 25 mg cím szerinti szabad Cys(OH) ciklikus intermediert kapunk. FAB tömegspektrum glicerinben: 827 (M + H)+, 825 (M-H)-. 20 mg Cys savat egy ekvivalensnyi mennyiségű, a kereskedelmi dihidroklorid egy ekvivalensnyi trietil-aminnal való kezelésével előállított Pro-Arg (NH2)HCl-vaI reagáltatunk DCC és HBT jelenlétében dimetil-formamid oldószerben, így a 3. példa szerinti terméket kapjuk. Hasonlóan Pro (OMe)-t kapcsolunk a Cys savhoz, híg nátrium-hidroxiddal hidrolizáljuk, így Pro savat kapunk, melyet ezután Arg(HCl) (OMe)-vel reagáltatva az észter-csoport enyhe körülmények között való elhidrolizálásával a 3. példa szerinti termék sav-megfelelőjét kapjuk. Kívánt esetben ezt a vegyületet a kálium-sója formájában választhatjuk el (lásd a 12. példát). Alternatív módon a Pro-Arg-(NH2)-t használhatjuk a kondenzáció során közvetlenül is. 4,5 mg a fenti módon előállított Pmp-D-Tyr(Et)-Phe-Val-Asn-Cys-OH és 1 ml metanol elegyét éteres diazometánnal kezeljük, és HPLC-vel tisztítjuk (eluens: CH3CN/H20/TFA 50:50:0,1 arányú elegye), így 4,3 mg (94%) metil-észtert kapunk. FAB tömegspektrum: m/z 841 (M + H)+. A termék nagynyomású folyadékkromatográfíával és vékonykromatográfiásan vizsgálva homogén. 11. példa A Pmp-D- Tyr(Et)-Phe- Val-Asn-Cys-Pro-Arg-NH2 előállítása terminális kondenzációval Merrifield gyantához kötött Boc-Pro-t állítunk elő úgy, hogy Boc-Pro Merrifield gyantához való kapcsolására a cézium-sós módszert alkalmazzuk, így Boc-Pro-OCH2-QH4-gyantät kapunk, melyet a szintézis kiindulási anyagaként használunk. A szintézist Beckman 990-B peptid szintetizátorban hajtjuk végre a következő módszer szerint. Az aminosavak három mól ekvivalensnyi menynyiségét a megfelelő oldószerükben feloldjuk [4- -MeBzl-Cys, Val, Phe Boc-származékait metilén-kloridban, Asn-t dimetil-formamidban, D-Tyr (Et)-t vagy BrBz-D-Tyr-t metilén-klorid/dimetil-formamid 1:1 arányú elegyébenés 4-MeBzl-Pmp-t metilén-kloridban], és diciklohexil-karbodiimid (DCC) és 1-hidroxi-benzotriazol (HBT) ekvimoláris mennyiségének jelenlétében kapcsoljuk őket.' Pmp kapcsolásakor a többitől eltérő módon 1,0 mól ekvivalens mennyiségű dimetil-amino-piridint alkalmazunk katalizátorként. A kapcsolás mérté5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 11
