196227. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új ciklikus, vazopresszin antagonista peptidek és az ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 196227 2 tű, permetezővel ellátott tartóedénybe helyezzük, melyet adagolószeleppel zárunk le. Ez az adag 100 dózisegységet tartalmaz, melyet ödémában szenvedő betegnek intranazálisan naponta 1—6 alkalommal adagolunk. ___________15. példa Prhp-D-Tyr-Phe- Val-Àsn-Cys-OH előállítása A cím szerinti terméket az 1. példában ismertetett szilárd fázisú eljárással állítjuk elő kiindulási anyagként Boc-Cys-Merrifield-gyantát alkalmazva, amelyet egymásután a megfelelő Boc-aminosawal kapcsolunk, majd a védőcsoportot hidrogén-fluoriddal eltávolítjuk, a terméket a gyantáról leválasztjuk és a leírt módon oxidativ úton ciklizáljuk. Tisztítás : 1. Cis oszlop kromatográfia 2. preparativ HPLC: 65 mg 0,5 mmól-ból (mólsúly 827) 65/827. 100=16% aminosav-tartalom : 85% N analízis alapján gyorsított atom bombázás (FAB): 827 pozitív megfigyelés 825 negatív megfigyelés aminosav analízis: Asp 1, Tyr 0,98, Cys 0,47, Phe 0,94, Val 0,96 HPLC analízis: egy csúcs 40% CH3CN és 0,1% vizes TFA oldattal 5p Ç15 oszlopon. 16. példa Pmp-D- Tyr(Et)-Phe- Val-Asn~Cys-Pro-OH előállítása A (II) általános képletű ciklikus savak általános szintézise: Boc-Pro-Merrifield gyantát állítunk elő Boc-Pro és Merrifield gyanta összekapcsolásával a céziumsó módszerével, amelynek során Boc-Pro-OCH2C5H4 gyantát kapunk, amelyet kiindulási anyagként alkalmazunk. À szintézist Beckman 990B peptid-szintetizáló berendezésen végezzük az alábbi eljárás szerint. Három ekvivalens aminosavat oldunk a megfelelő oldószerben (4-MeBzl)-Cys Boc származékát, Val-t, Phe-t, és 4-MeBzl-Pmp-t metilénkloridban, Asn-t dimetil-formamidban, X- t, így D-Tyr(Et)-t vagy BrZ-D-Tyr-t 1:1 metilénklorid/dimetil-formamid elegyben, majd ekvimoláris mennyiségű diciklo-hexil-karbodiimid (DCC) és 1-hidroxi-benzotriazol (HBT) segítségével összekapcsoljuk, kivéve a 4-MeBzl-Pmp-t, ahol 1,0 ekvivalens dimetil-amino-piridint alkalmazunk katalizátorként. A kapcsolás mértékét alikvot minta kvalitatív ninhidrin analízisével határozzuk meg, és szükség esetén a kapcsolást megismételjük. A Boc-csoportot 1:1 trifluorecetsav/metilénklorid segítségével lehasítjuk, majd mosás után a szabad amint 5% diizopropil-etil-amin/metilénklorid segítségével kinyerjük. A peptid szekvenciáját a 4- -MeBzl-Pmp hozzáadása előtt meghatároztuk, majd ellenőriztük a homogenitást. Az utolsó kapcsolás után a pepiidet szárítjuk, amelynek során Pmp(4-MeBzl)-D-Tyr(Et)-Phe-VaI-Asn-Cys(4- -MeBzl)-Pro-OH esetén 2,24 g peptid gyantát kapunk. 1,1 g (0,5 mmól) fenti peptid gyantát 3 ml anizollal keverünk 60 percen keresztül 0 °C hőmérsékleten (jeges fürdő) 25 ml folyékony, vízmentes hidro-14 génfluoridban. A hidrogénfluoridot ezután csökkentett nyomáson 0 °C hőmérsékleten eltávolítjuk. A maradékot etíléterrel négyszer mossuk, és a pepiidet dimetil-formamiddal háromszor 10 ml, 20% ecetsavval háromszor 10 ml és 0,3 n ammóniumhidroxiddal eluáljuk. A szűrletet 21 kiszellőztetett vízhez adjuk és koncentrált ammónium-hidroxiddal pH = 7,1 értékre állítjuk. Ezután keverés közben 0,01 mól kálium-ferri-cianid oldatot csepegtetünk hozzá és enyhén sárga szín megjelenéséig folyamatosan keverjük. A kapott oldatot oktadecilszilánnal bevont szilikagéllel (C,8) töltött oszlopon (5 cm átmérőjű és 15 cm hosszú) hajtjuk át. Az oszlopot 350 ml vízzel mossuk és a pepiidet 500 ml 1:1 acetonitril/víz (0,25% trifluor-ecetsav) elegygyel 20 ml frakciókban eluáljuk. A 11—17. frakciókat egyesítjük és bepároljuk. A maradékot koncentrált ecetsavban oldjuk, vízzel hígítjuk és liofilizáljuk. így 189 mg Pmp-D-Tyr(Et)-Phe-Val-Asn-Cys»Pro-OH pepiidet kapunk, amely a módosított peptidek előállítására tisztítás nélkül felhasználható. Hasonló módon állítható elő a Pmp-D-Tyr-Phe-Val-Asn Cys-Pro-OH változat. 17. példa Prhp-D-Tyr(Et)-Phe-Val-Asn-Cys-Pro-A rg-NH2 előállítása 8.0 g (8,7 mmól) Pmp-D-Tyr(Et)-Phe-Val-Asn^Cys-Pro-OH-t, 1,52 g (11,2 mmól) 1-hidroxi-benzotriazol-hidrátot, 120 ml dimetil-formamidot és 30 ml acetonitrilt 20 °C hőmérsékleten keverünk, majd 2,0 g (9,6 mmól) N,N-diciklohexil-karbodiimidet adunk hozzá. A reakcióelegyet 2,5 órán keresztül keverjük, miközben diciklohexil-karbamid csapadék válik le. Ezután 20 perc alatt 2,58 g (9,77 mmól) argininamid-dihidroklorid-hidrát és 1,50 g (11,6 mmól) diizopropil-etil-amin 16 ml dimetil-formamidban felvett oldatát adjuk hozzá, 20 órán keresztül 20 °C hőmérsékleten keverjük, majd hagyjuk szobahőmérsékletre melegedni. Hozzáadunk 4 ml ecetsavat és 3 ml vizet, 30 percen keresztül keverjük, majd a karbamidot kiszűrjük és az oldószert magas vákuumban eltávolitjuk. A nyersterméket acetonitrillel és etilacetátta! eldörzsöljük és 1 órán keresztül 10 °C hőmérsékleten keverjük. Szűrés és szárítás után nyers Pmp-D-Tyr(Et)-Phe-Val-Asn-Cys-Pro-Arg-NH2-t kapunk, amelyr ek tisztasága HPLC szerint 71%. Kitermelés: 76%. 2.0 g peptidet nagynyomású folyadék kromatográfia segítségével 15—20 - „VYDAC” töltésű 4 mmx50 cm 2500 ml A oldószereleggyel, majd 1200 ml B oldószereleggyel végzett elúció során 1,5 g Pmp-D-Tyr(Et)-Phe-Val-Asn-Cys-Pro-Arg-NHj-t kapunk, amelynek peptid-tartalma 83% (az 5 to 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
