196131. lajstromszámú szabadalom • Eljárás polipeptid vakcina előállítására
1 2 196.131 a HA2 80 N-terminális gyöke) NSI (NSI) NS2 (NS2) M30 (NSI és M) (lásd 1. példa). Ezek mindegyikéhez tartozó kódoló szekvenciákat tartalmazó molekulák úgy származnak, ahogyan ezt Young és munkatársai leírták az „Origin of Pandemic Influenza Viruses” (A járványos influenza vírusok eredete) című kiadványban (szerkesztő: W. G. Laver, kiadó Elsevier Science Publishing Co.), és pASldelta- EH-ban fejeződnek ki, lényegében úgy, ahogy fentebb leírtuk, azzal a különbséggel, hogy a bakteriális üledék újra szuszpendálását, a lizozimos kezelést, ultrahangos kezelést és centrifugálást követően az NS1 fehérjét a felülúszó tartalmazza. A felülúszót MgCl2-re 100 mmól/literessé tesszük és egy órán át kevertetjük 4°C hőmérsékleten. Az oldatot ezután centrifugáljuk (15000 ford/perc, 30 perc), hogy az NSl-et üledékbe vigyük. Az üledéket újra szuszpendáljuk A pufféiban és ismét 100 mmól/ /literre állítjuk be MgCl-re, hogy újra kicsapjuk az NS1 fehérjét. Újabb centrifugálást követően az üledéket megint szuszpendáljuk a pufferban és háromszor dializáljuk 1—1 liter oldat ellen, amely 10 mmól/liter trisz-HCl-t és 1 mmól/liter Edta-t tartalmaz. Az oldatot ezután újra centrifugáljuk, hogy minden szilárd anyagot eltávolítsunk, és az NS1 fehérjét tartalmazó felülúszót összegyűjtjük és méréshez használjuk. A citotoxikus T sejt vizsgálatát lényegében a következőképpen végezzük. Lépsejteket izolálunk vírus-immunizált és nein-immunizált egerekből és in vitro tenyésztjük. A sejteket csoportokra osztjuk és különböző antigéneknek tesszük ki 90 percig in vitro. Az 10 15 20 3C antigéneket ezután eltávolítjuk a sejtek ismételt mosásával, és a sejteket ezután 5 napig tenyésztjük, hogy lehetővé tegyük a stimulált populációk kiterjedését. A stimulált sejteket, vagyis effektor sejteket, vírussal fertőzött és nem fertőzött P815 célsejtekkel keverjük, amelyeket előkezeltünk slCr-el. Az slCr szignifikáns kibocsátása a tenyésztő tápközegbe jelzi a szekunder citotoxikus T sejtek (2° CTL) jelenlétét, amelyek az antigénnel történt in vitro stimulálás során jöttek létre. Az elölés fajlagosságát két úton vizsgáljuk: (1) különböző antigénekkel fertőzött célsejteket vizsgálunk elölésre, és (2) lépsejteket izolálunk egerekből, amelyeket előzőleg különböző vírusokkal immunizáltunk. A vizsgálat linearitását is vizsgáljuk, különböző célsejt: effektor sejt hányadosokat alkalmazva, és különböző mennyiségű antigéneket alkalmazva, amint ezeket a következő táblázatokban jelezzük, amelyek bemutatás céljaira szolgáló eredményeket tartalmazzák. Az eredmények listája az alábbiakban két effektor: célsejt hányadost (30:1 és 10:1) mutat be. A táblázatokban levő eredmények a tápközegbe kibocsátott 51 Cr százalékában vannak kifejezve, összehasonlítva az összes sejtben levő 51 Cr menynyiségével, amint ezt a sejtek detergens szolubilizá: lásával meghatározzuk. A szignifikánsan pozitív eredményeket bekeretezve adjuk meg. A vizsgálatokhoz alkalmazott vírusok a következők: A/PR/8/34 (HIN1) A/Port Chalmers/174 (H3N2) A/Brazil/178 (H2N1) A/Singapore/157 (H2N2) („PR8”) („A/PC") („A/B2”) („A/Sing”) 35 1. Tábládat 2° CT1 válasz stimulálása E. coli eredetű polipeptidek által A 2° stimuláláshoz PR8 — P815 Nem fertőzött — P815 használt antigén 30 10 30 10 PR8 36.0 27,2 0,2- 5,2 C13 24 jug/ml 10,7 10.7 0,5-4,4 12/rg/ml 10,6 8,1 0,5-3,6 6 Atg/ml 9,5 4,4 1,4-4,1 NSj 24 pg/ml 0.4 2,8-4,0- 2,7 12 pg/ml 1,8 . - 1,5 0,2-4,1 6 Ug/ml 0,5- 0,2- 0,3-5,2 N30 24 /rg/ml 1,0 .~ 3,9- 1,6- 3,3 12pg/ml 1,8- 1,2-1,9 U 6 jug/ml 5,7- 1,5-3,6-6,2 Semmi -2,7- 4,1,-4,7-4,0 5
