196131. lajstromszámú szabadalom • Eljárás polipeptid vakcina előállítására
1 2 lül, és a pBR 322 375 bázispáiját, beiktatjuk a pASldeltaEH BamHI helyére. Az így létrejött plazmid, a pASldeItaEH/801 autentikus NSl-et fejez ki (230 aminosav). Ennek a plazmidnak van egy Ncol helye a 81. és 82. aminosavakhoz szolgáló kodonok között, és egy Nrul helye az NS szekvenciáktól 3’ felé. A BamHI hely az 1. és 2. aminosavak között megmarad. Egy Ml fehérje C-terminális 50 aminosavához tartozó kódoló szekvenciát hordozó 571 bázispáros fragmenst nyerünk olyan módon, hogy elhasítjuk a pAPR701-et Ncol-el és EcoR5-el. Ezt a fragmenst beiktatjuk az Ncol és Nrul helyek közé a pASldelta-EH/801-ben, a nevezett fragmensnek a plazmidból való küktatását követően. Az így létrejött plazmid, a pM30, egy fúziós fehérjét kódol, amely az NS1 első 81 anrinosavából áll az Ml utolsó 50 aminosavához fuzionálva. Az Ncol és BamHI helyek megmaradnak. 2. példa pC13 plazmid A pJZ 102 plazmid egy pBR322 eredetű klónozó vektor, amely teljes HA fehérjét (A/PR/8/34) kódoló területet hordozza: Ezt Young és munkatársai írták le, amint ezt az 1. példában már idéztük. A pBglII plazmid egy pBR322 eredetű klónozó vektor, amely egy BglII linkért hordoz a pBR322-ben levő Nrul helynél. A pJZ102-t Mnll-el hasítjuk. BglII kapcsolókat ligálunk mindkét véghez, és a HA2-t tartalmazó fragmenst ligációval iktatjuk be a pBglII-be. Az 5’ csatlakozás az így létrejött pBglII/HA2 plazmidban a következő szekvenciával rendelkezik: 1 2 3 5’ AGATCTG TCCAGA GGT---3’ Az 1. terület a BglII kapcsolatból származik és aszparagint, valamin leucint kódol. A 2. terület HA1- ből származik és szerint, valamint arginint kódol. A 3. terület HA2-ből származik, és a HA2 alegység öszszes aminosavát kódolja. A 3’ csatlakozás szekvenciája a következő: 3 4 5 6 5'—ATATGCATC TGA GATTAGAATTTCA CAGATCT A 4. terület a HA2 stop kódon. Az 5. terület a vírus eredetű nem kódoló szekvencia. A 6. terület a BglII linkerből származik. A HA2 kódoló szekvenciát hordozó 691 bázispáros fragmenst nyerünk a pBGlII/HA2 hasításával BglII-vel. A frangmens végeit betöltjük DNS polimeráz I/DNApolI/Klenow-frangmens segítségével, és pASldeltaEH/801-be ligáljuk, amelyet előzőleg Ncol-el hasítottunk és hasonló módon Klenow-fragmenssel a végeit kitöltöttük. Az így létrejött plazmid a pCI3. Az NS1-HA2 tompa vépű elágazás szekvenciája a következő: 7 1 2 3 5' AAAATGACCATG GATCTG TCCAGA GGT 3’ A 7: terület az NS1 génből származik. Az 1., 2. és 3. területek meghatározása a fenti. 3. példa A C13 fehérje előállítása E. Coli N5151 gazdaszervezetet, amely egy hőmérséklet érzékeny lambda-lizogén (cI857|, pC13-al transzformáljuk. A transzformánsokat 32 C hőmérsékleten növesztjük a közép-log fázisig (A260= 0,6) LB tápközegben, amely 100 jug/ml arngicillinnel van kiegészítve. A tenyészeteket ezután 42 C hőmérsékletre állítjuk be, hogy a cl-t inaktiváljuk, és így inkdukáljuk a Cl3 fehérje szintézisét. 2 óra múlva 42 °C hőmérsékleten a baktériumokat centrifugálással összegyűjtjük (3500 fordulat/perc, 20 perc) és a bakteriális üledéket —20 °C hőmérsékleten fagyasztjuk. Az üledéket felengedtetjük és újra szuszpendáljuk. A pufferban (50 mmól/liter trisz -HC1, pH 8,0; 2 mmól/liter EDTA, 1 mmól/liter ditiotreitol, 5% térf./térf./glicerin). Lizozimot adunk hozzá 0,2 mg/ml végső koncentrációban, és a keveréket jégen inkubáljuk 20 percen át. A keveréket azután Waring blender keverőben kezeljük nagy sebességgel, hatszor 15 másodperces lökéseket alkalmazva. A szuszpenziót azután 1 percig ultrahanggal kezeljük Branson-szonda ultrahangos készülékkel. A keveréket ezután centrifugáljuk (15000 ford/perc, 30 perc). Az üledéket újra szuszpendáljuk A pufferban ultrahangos kezelés közben (4 x 15 másodperces lökések). A keveréket azután 0,1%-osra állítjuk be dezoxikolátra, és egy óra hosszat kevertetjük 4 °C hőmérsékleten. A keveréket centrifugáljuk (15000 ford/perc, 30 perc), és a fehérjét üledékbe visszük. A dezoxikolátos kezelést megismételjük és az így létrejött üledéket újra szuszpendáljuk A pufferben, ultrahangos kezelés közben. A szuszpenziót 1%-ossá tesszük Triton X-100-ra, és egy óra hosszat kevertetjük 4 °C hőmérsékleten. A keveréket újra centrifugáljuk (15000 ford/perc, 30 perc), és a fehérje-üledéket összegyűjtjük. A fehérjét ultrahangos kezeléssel újra szuszpendáljuk és a fehérjét karbamid-oldattal (4 mól/liter végső koncentráció) szolubilizáljuk. Ezt az oldatot centrifugáljuk', hogy eltávolítsunk mindenféle darabos anyagot (15000 ford/perc, 30 perc), és a felülúszót összegyűjtjük és dializáljuk háromszor 10 mmól/liter trisz-HCl-t és 1 mmói/liter EDTA-t tartalmazó oldattal (pH 7,5) szemben, hogy a karbamidot eltávolítsuk. A fehérje-oldatot ismét centrifugáljuk, hogy eltávolítsunk minden darabos anyagot (15000 ford/perc, 30 perc), és a felülúszót, amely a C13 fehérjét tartalmazza, összegyűjtjük és a vizsgálatokhoz használjuk fel.. 4. példa T sejt mérés . A C13 fehérjének azt a képességét, hogy citotoxikus T sejt választ indukál in vitro mérésben, összehasonlítjuk más, szintén A/PR/8/34 eredetű fehérjék képességével. A többi fehérjéket a következőképpen azonosítjuk: C7 teljes HA) Delta 7 (Hal és HA2-nek 80 N terminális gyöke) C 36 (HA2) Delta 13 Az NS1 -nek 80 N-terminális gyöké és 196.131-/ 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 4
