196077. lajstromszámú szabadalom • Eljárás inozit trifoszfátok és ilyen vegyületeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 2 sával ^ leállítjuk. A szuszpenziót centrifugáljuk és a felülúszót elválasztjuk. 300 ml felülúszót Ioncserélő oszlopra visszük (Dowex 1. klorid-forma, 25 mm x 250 mm) és lineáris gradiensű (0-0,7 n) sósavval eluáljuk. Az eluátumok alikvot részeit teljesen elhidrolizáljuk a foszfor és inozittartalom meghatározása céljából. Két frakciót nyerünk, amelyben a foszfor/inozit arány 3 :1. A kapott IP3 mennyiségére az eredetileg adagolt nátrium-fitáz 80%-a. 13. példa Inozit-trifoszfát frakcionálása A 2. példában leírtak szerint járunk el, kivéve, hogy a 12. példa szerinti első frakciót kromatografáljuk, amikoris három csúcsot nyerünk, amelyeket H-NMR-rel vizsgálunk. A három csúcs mio-inozit-1,2,6-trifoszfátból, mio-inozit-1,2,3-trifoszfátból, illetve mio inozit-1.3,4-trifoszfátból áll. 14. példa D-mio-inozit-1,2 6-trifoszfát-cinksó előállítása A 13. példa szerint nyert D-mio-inozit-1,2,6- -trifoszfát-tartalmú frakció 100 ml-ét vizes ZnO oldattal pH = 7-ig semlegesítjük, a képződött cinksót 100 ml etanollal kicsapjuk, centrifugálással elválasztjuk, átkristályosítjuk és vákuumban szárítjuk. A kapott cinksót kémiailag analizálva meghatározzuk a szén foszfor, oxigén és cink tartalmát. A kapott eredményeket az 1. Táblázat tartalmazza. A só képlete: Zn3IP3, kitermelés 90%, az eredeti D-mio-inozot-1 2.6-trifoszfátra számolva. 15. példa Pékélesztő-eredetű nátrium-fitát hidrolízise, és az inozit-trifoszfátok keverékének frakcionálása 0,7 g nátrium-fitátot (kukorica-eredetű, Sigma Chemical Co.) feloldunk 600 ml nátrium-acetát pufferban (pH 4,6). 50 g pékélesztőt (Jastbolaget, Svédország) (szárazanyag: 28%, nitrogéntartalom: 2%, foszfortartalom: 0,4%), adunk hozzá keverés közben, és az inkubálást folytatjuk 45°C- hőmérsékleten. A defoszforilezést olyan módon követjük, hogy meghatározzuk a kibocsájtott szervetlen foszfort. 7 óra múlva, amikor a szervetlen foszfor 50%-a felszabadul, a hidrolízist leállítjuk 30 ml ammónia hozzáadásával a pH-t 12-re állítva. A szuszpenziót centrifugáljuk és a felülúszót összegyűjtjük. 400 ml felülúszót átengedünk ioncserélő oszlopon (Dowex 1, klorid-forma, 25 mm x 250 mm), és sósav lineáris gradiensével eluáljuk (0—0,7 n HC1). Az eluált frakciókból alikvotokat hidrolizálunk teljes mértékben abból a célból, hogy meghatározzuk a foszfor- és az inozit-tartalmat. A foszformenynyiségeket az elvált térfogat függvényében a 10. ábrán mutatjuk be. A csúcsok különböző inozit-foszfátoknak felelnek meg, azaz egy olyan csúcs, amelynél a foszfor és az inozit aránya 3:1, inozit-trifoszfátokat tartalmaz, stb Kitermelés 50% a kiindulási nátrium-fitátra számolva. 16. példa Az inozit-trifoszfátok izomerjeinek szerkezeti meghatározása A 15. példában nyert frakciót, amely 3 : 1 arányban tartalmazza a foszfort és az inozitot, semlegesítjük és a H-NMR-rel végzett elemzés előtt bepároljuk. Az adatok azt mutatják, hogy a csúcs mio-inozit-l,2-6-trifoszfátot tartalmaz. Az adatok megfelelnek a 3. ábrán bemutatott spektrum adataival. 17. példa Mio-inozit-trifoszfát opitikai izomerjének meghatározása A 4. példa szerint járunk el, azzal a különbséggel, hogy 10 mg vegyületet vizsgálunk a 16. példa szerinti NMR-analízissel. A II. ábra alapján megállapítható, hogy a vegyület egy optikai izpmer, a D-mio-inozit-1,2,6-trifoszfát, amely sósavas kezeléssel L-mio-inozot-l,3,4-trifoszfáttá rendeződik át. 18. példa D-mio-inozit-1,2,6-trifoszfát nátriumsó előállítása A 15. példa szerint nyert D-mio-inozit-1,2,6-tri-foszfát-tartalmú frakció 100 ml-ét vizes nátrium-hidroxid adagolásával pH = 7-ig semlegesítjük, majd képződött sót 100 ml etanollal kicsapjuk, jük a sót centrifugálással elválasztjuk, átkristályosítjuk és vákuumban szárítjuk. A kapott só szerkezetét H-NMR-vizsgálattal igazoltuk és kémiai vizsgálattal meghatároztuk a szén, foszfor, oxigén és nátrium-tartalmat. A kapott eredményeket az 1. Táblázat tartalmazza. A só képlete Na6IP3. 19. példa Nátrium-fitát kémiai hidrolízise és a kapott inozit-trifoszfátok frakcionálása 1,9 g nátrium-fitát-ot (kukorica-eredetű, Sigma Chemical Co.) 15 ml sósavban oldunk, majd vákuumban, lezárt csőben 105°C-on 5 órán át melegítjük. Ez idő után 34% szervetlen foszfor szabadul fel. A reakciókeverék 5 ml-ét pH = 7-ig vizes nátrium-hidroxiddal semlegesítjük, majd ioncserélő oszlopon (Dowex, 1, klorid-forma, 10 mm x 150 mm) átengedjük és 0-0.7 n koncentráció-sorú sósavval eluáljuk. Az eluátumok alikvot részét teljesen hidrolizáljuk a foszfor és inozit tartalom meghatározására. A foszfortartalom alakulását a 2. ábra szemlélteti. Azokat a frakciókat, amelyekben a foszfor- : inozit arány 3 : 1 volt, összegyűjtöttük. A H-NMR vizsgálat az izomerek jelenlétét igazolta. 20. példa Inozit-foszfátok kémiai szintézise Uvegdugós lombikba polifoszforsavat (80% P2O5 tartalom, 3,5 g) adagolunk, 150°C-ra melegítjük, hozzáadunk 0,2 g monoinozitot és a hőmérsékletet 2 órán át tartjuk. Ekkor a pH-értékét vizes nátrium-hidroxiddal 7-es értékre állítjuk be. A kívánt terméket 10% feleslegben adagolt 0,1 mólos bárium-acetát adagolásával kicsapva, báriumsó formájában nyerjük. A báriumsó 20 mg-ját hígított sósavval elkeverjük ily módon szabad savvá alakítjuk, amelyet HPLC- vel vizsgálunk. Az analízist ismert inozit-foszfáttal való kalibráció alapján végeztük (a kromatogramot a 3 ábra szemlélteti) és az inozit-foszfátokat tartalmazó frakciókat összegyűjtöttük. Az izomer termékek jelenlétét H-NMR-vizsgálattal is igazoltuk. Az inozit-trifoszfát mennyisége az összes inozit-trifoszfátok 20%-a. 196 077 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 6
