196077. lajstromszámú szabadalom • Eljárás inozit trifoszfátok és ilyen vegyületeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 2-3-trifoszfátot, ill. mio-inozit-1,3,4-trifoszfátot tartalmaznak. Az 1 példában nyert második frakciót, amelyben a foszfor/inozit arány 3:1, elemezzük N-NMR-rel. Az NMR-spektrumot a 4. ábrán mutatjuk be. Az adatok azt mutatják, hogy a frakció mio-inozit-1,2,5- -trifoszfátot tartalmaz. Az NMR vizsgálatokhoz Nicolet 360 WB spektrometert alkalmaztunk, a belső standard tetrametilén-szilán volt. 4. példa Az inozit-trifoszfát optikai izomeijeinek meghatározása 20—20 mg anyagot, amelyeket a 3. példa szerint NMR-rel mio-inozit-1.2,6-trifoszfátnak és mio-inozit-1,3 4-trifoszfátnak határoztunk meg, tovább kromatografálunk acetilezett cellulóz alapú királis oszlopon (20 mm x 300 mm, Merck) eluensként etanol és víz keverékét alkalmazva. A frakciókat polariméterrel elemezzük. A kapott eredményeket a 7. ábrán mutatjuk be. Az ábrákból látható, hogy mindegyik komponenst egy optikai izomert tartalmaz, D-mio-inozit-1,2/5-trifoszfátot. illetve L-mio-inozit-1,3,4- -trifoszfátot. 5. példa Inozit-trifoszfátok pKa értékének meghatározása Az 1. példa szerint nyert első frakció — amelyben a foszfor/inozit arány 3 : 1 - 10 ml-ét 0,01 n NaOH-dal titráljuk. A titrálás alatt a pH értékét elektródokkal mérjük. A kapott eredményeket a 8. ábra szemlélteti. A kapott pKa értékek a következők: pKa 1 = 4,7 pKa 2 = 7.5 6. példa Inozit-trifoszfát és kalcium, cink, ill. kadnium közötti realtív kötési erősség meghatározása Az 1. példa szerinti termék (első frakció, inozit/ foszfor arány 1 : 3), 10 ml-ét 0,01 n NaOH-dal titráljuk 0.2 mmól kalcium, cink illetve kadmium jelenlétében Az inozit-trifoszfát-fémkomplex képzésre való nagyobb hajlam a pH nagyobb mértékű csökkenését eredményezi adott térfogatú NaOH adagolásával. Ahogy az a 9. ábra szerinti görbéből kitűnik az IP3 -ra vonatkozó realtív kötési erősség a vizsgált ionok esetében a következők szerint növekszik: Ca < Zn <Cd 7. példa D-niio-inozit-1,2,6-trifoszfát-kalciumsó előállítása A 2. példa szerint nyert D-mio-inozit-l,2,6-trifoszfát-tartalmú frakció 100 ml-ét kalcium-hidroxid adagolásával semlegesítünk pH = 7 értékig. A képződő kalciumsót etanol adagolásával kicsapjuk, centrifugálással elválasztjuk átkristályosítjuk és vákuumban szárítjuk. A tisztított kalciumsó szerkezetét H-NMR-rel vizsgáltuk és kémiailag is meghatároztuk a foszfor, szén oxigén és kalcium tartalmat. A kapott eredményeket az 1. táblázat tartalmazza. A vizsgálati eredmények alapján a vegyület képlete Ca3IP3. Kitermelés 80%-a az eredeti frakcióban jelenlévő D-amo-inozit-1,2.6-trifoszfát-mennyiségére számolva. 8. példa L-mio inozit-1 3,4-trifoszfát előállítása A 2. példa szerint nyert L-mio-inozit-1,3,4- » -trifoszfát-tartalmú frakció 100 ml-ét kalcium-ludroxld adagolásával pH- = 7-ig semlegesítjük, a képződő kalciumsót 100 ml etanollal kicsapjuk, centrifugálással elválasztjuk, átkrsitályosítjuk. vákuumban szárítjuk. A tisztított kalciumsó szerkezetét H-NMR vizsgálattal igazoltuk kémiai analízissel pedig meghatároztuk. a szén, foszfor, oxigén és kalcium tartalmát. A só képlete Ca3IP3. (lásd 1. táblázat) 9. példa Mio-inozit-1 2,3-trifoszfát-kalciumsó előállítása A 2. példa szerint nyert mio-inozit-1,2,3-trifoszfát tartalmú frakció 100 ml-ét pH = 7-ig semlegesítjük kalcium-hidroxid vizes oldatának adagolásával, a képződő kalciumsót 100 ml etanollal kicsapjuk, centrifugálással elválasztjuk, átkristályosítjuk és vákuumban szárítjuk. A tisztított kalciumsó szerkezetét H-NMR-vizsgálattal igazoltuk és kémiai analízissel meghatároztuk az összetételét. A kapott eredményeket az 1. Táblázat tartalmazza. A só képlete Ca3IP3. 10. példa D-mio-inozit-l,2,5-trifoszfát-kalciumsó előállítása Az 1. példa szerint nyert D-mio-inozit-l,2,5-trifoszfát-tartalmú frakció 100 ml-ét pH = 7-ig kalcium-hidroxid vizes oldatának adagolásával semlegesítjük. a képződött kalciumsót 100 ml etanollal kicsapjuk centrifugálással elválasztjuk, átkristályosítjuk és vákuumban szárítjuk. A tisztított kalciumsó szerkezetét H-NMR-vizsgálattal igazoltuk kémiai analízissel meghatároztuk az összetételét. A kapott eredményeket az 1. Táblázatban foglaltuk össze. A só képlete: Ca3IP3. 11. példa D-mio inozit-l(2f6-trifoszfát-kalciumsó infravörös spektruma A 7. példa szerint nyert kalciumsót IR spektroszkópiával vizsgáltuk. A jellemző sávok a következők: 3500 cm' — OH 2900 cm"1 - CH 1600 cm'1 - OH 1100 cm’l — C-0 és -P 1000 cm'l - C-0 és-P 800 cm'1 -C-C 12. példa Nátrium-fitát hidrolízise búzakorpával és a kapott inozit-foszfát keverék frakcionálása 10 g nátrium-fitátot (Sigma Chemical Co., kukoricaeredetű) feloldunk 500 ml nátriurnacetát pufferban (pH = 5.0). A hőmérsékletet 37°C-ra emeljük és keverés közben 10 g búzakorpát adunk hozzá, majd a keveréket 37°C-on inkubáljuk. A defoszforileződést a felszabaduló szervetlen foszfor mennyiségének meghatározásával növeljük. A hidrolízist 2 óra elteltével, amikor a felszabadult szervetlen foszfor mennyisége 50%, 100 ml ammónia adagolá196 077 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 5
