196077. lajstromszámú szabadalom • Eljárás inozit trifoszfátok és ilyen vegyületeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 2 zátorként, Az IP3 vegyületek továbbá védőhatásúak magoknál, adalékként alkalmazhatók fogkrémeknél, korróziógátlóként festékek, lakkok, kenőolajok esetében, fémeknél felületkezelésre, tisztítószerek komponenseként, lángálló-szerként, felhasználhatók a nyomdaiparban, mikroorganizmusok esetében alfatoxin termelést gátló szerként, továbbá növelik az amiláz enzim-aktivitását is. A fenti célokra mind a közvetlen fermentációval előállított, mind pedig az előzőekben leírt adagolási eljárással előállított kompozíciók alkalmasak. A találmány szerinti eljárással előállított IP3 izomerek a következő általános képleteknek felelnek meg: D-mio-inozit-1.2 6-trifoszfát, (I) általános képletű — amely képletben X jelentése hidrogénatom, legalább egy vagy több értékű kation vagy ezek keveréke, n az ionok száma és z az ion tötése, D-mio-inozit-1 2.5-trifoszfát: (II) általános képlet, amelyben X, n ész jelentése a fenti, Mio-inozit-1 2.3 trifoszfát, (III) általános képlet, amelyben X, n és z jelentése a fenti, L-mio-inozit-1.3.4-trifoszfát: (IV) általános képlet, amelyben X, n és z jelentése a fenti. Mindegyik fenti képlet esetében n értéke 6 és 1 közötti szám és z értéke 1-6, előnyösen n értéke 3-6 és z értéke 3 2 vagy 1. A találmány szerinti eljárással előállított IP3 vegyületek különösen hatásosak a fentiekben felsorolt esetekben és különös előnyük, hogy mellékhatásoktól mentesek. A fenti IP3 vegyületek közül különösen a D-mio inozit-1,2,6-trifoszfát hatásos és aktivitása a többi vegyületét, különösen a D-mio-inozit-1,4,5- -trífoszfátét felülmúlja. A D-mio-inozit-1.2 6-trifoszfát Cd-mal képzett komplexének stabilitása felülmúlja a D-mio-inozit-1 2 5-trifoszfát Cd-komplexének stabilitását. Kisebb mértékben de különbség van a különböző IP3 izomerek gyógyászati felhasználásában is, így például az L-mio-inozit-1 3,4-trifoszfát, a D-mio-inozit-1,2,5- -trifoszfát vagy a mio-inozit-1,2,3-trifoszfát előnyösebben alkalmazható, mint például a D-mio-inozit-1,4,5-trifoszfát. A találmány szerinti eljárást részletesebben a következő példákkal illusztráljuk. Az 1. és 2. példa a nátrium-fitát búza-fitán enzimmel való hidrolízisét és a kapott inozit-foszfátok frakcionálását mutatja be. A 3. és 4. példa az IP3 izomerek szerkezetének meghatározását, az 5 példa az IP3 pKa-értékének meghatározását a 6. példa az IP3 vegyületek és Ca, Zn és Cd ionok közötti kötés erősségét, az 7-10. példák a kalcium-sók előállítását, a 11. példa a D-mio-inozit-trifoszfát-kalciumsó infravörös spektrumát. a 12. és 13. példa a nátrium-fitát búzakorpával való hidrolízisét és a kapott inozit-foszfátok frakcionálását. A 14 példa a D-mio-inozit-1,2,6-trifoszfátcinksó előállítását a 15.-17. példák a nátrium-fitát pékélesztővel való hidrolízisét és a kapott inozit-foszfátok frakcionálását. valamint a kapott egyetlen IP3 izomer meghatározását ismertetik. A 18. példában a D-mio-inozit-1,2.6-trifoszfát-nátriumsó előállítását a 19. példa a nátrium-fitát sósavval végzett kémiai hidrolízisét és a kapott anyag frakcionálását, a 20. példa a mio-inozitból és poli-foszforsavból történő inozit-foszfát kémiai előállítását és a kapott IP3 szerkezeti meghatározását, a 21. példa a rizskorpából származó fitinsav hidrolízisét és a kapott inozit-foszfátok elválasztását és analízisét a 22. példa a D-mio inozit-1.2 6-trifoszfát különböző sóinak jellemzését, a 23 példa az IP3 vegyületek vérlemezke-agg' regációt gátló hatását mutatja be dohányos emberek esetében, míg a 24. példa egerekkel végzett kísérletet mutat be, amelyben a találmány szerinti eljárással előállított IP3 vegyületekkel a magas vércukor szintet okozó szabad gyököket blokkoljuk. 1 példa Nátrium-fitát hidrolízise búza-eredetű fitázzal, és az inozit-foszfátok keverékének frakcionálása. 1,6 g nátrium-fitátot (kukorica-eredetű, Sigma Chemical Co.) feloldunk 650 ml nátrium-acetát pufferban (pH 5.2) 2,7 g búza-eredetű fitázt (EC 3.1.3.26. 0 015 egység/mg, Sigma Chemical Co.) adunk hozzá és a keveréket 380C hőmérsékleten inku báljuk. A foszfor-mentesítést a kibocsájtott szervetlen foszfor meghatározásával követjük. 3 órával később amikor a szervetlen foszfát 50%-ka felszabadul, a hidrolízist 30 ml ammónia hozzáadásával pH 12-re beállítással, leállítjuk. Inozit-foszfátokat tartalmazó folyékony keveréket nyerünk 350 ml keveréket engedünk át ioncserélő oszlopon (Dowex 1. klorid-forma, 25 mm x 250 mm), és eluáljuk. sósav lineáris gradiensével (0 -0,7 n HC1). Az eluált frakciók A küb alíkvotjait teljesen elhidrolizáljuk abból a célból, hogy meghatározzuk a foszfor- és az inozit tartalmát. A csúcsok megfelelnek a különböző inoz.it foszfátoknak, azaz egy olyan csúcs, amelyben a foszfor aránya az inozithoz 3 : 1, inozit-trifoszfátot tartalmaz, stb. Két olyan frakciót kapunk. amelyben a foszfor aránya az inozithoz 3:1. A két frakcióban lévő inozít-foszfát mennyisége az beadagolt nátrium-fitáz mennyiségének 45%-a. A különböző foszformennyiségeket az elvált térfogatok függvényében az 1. ábrán ábrázoltuk. 2 példa Az inozit-trifoszfátok frakcionálása Az 1. példában nyert első frakcióból 100 ml-t, amelyben a foszfor/inozit aránya 3 :1, semlegesítünk és báriumsó formájában kicsapjuk, 10% fölöslegben lévő 0.1 mól/l-es báríum-acetát oldat hozzáadásával. 600 g kicsapott sót feloldunk 50 ml hígított sósavban. Az oldatot ioncserélő oszlopon szeparáljuk (Dowex 1, klorid-forma, 25 mm x 2500 eluensként hígított sósavat alkalmazva. Az eluált frakciók alíkvotjait foszforra elemezzük. A foszformennyiségeket az eluált térfogat függvényében a 2. ábrán mutatjuk be. Három csúcs látható, amelyek az inozit-trifoszfátok izomerjeit tartalmazzák. A mio-inozit-1,2 6-trifoszfát mennyisége kb. a teljes képződött inozit-trifoszfát 60%-a. A három IP3 csúcs H-NMR vizsgálatát a következő 3. példában mutatjuk be. 3. példa Az inozit-trifoszfátok izomerjeinek szerkezet-meghatározása NMR-rel A 2. példában nyert három csúcsot H-NMR-rel elemezzük. Az NMR-spcktrumokat a 3., 4. és 5. ábrán mutatjuk be. Az adatok azt mutatják, hogy a csúcsok mio-inozit-1,2,6-trifoszfátot, mio-inozit-1,2-196 077 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 4
