196077. lajstromszámú szabadalom • Eljárás inozit trifoszfátok és ilyen vegyületeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 2 2) A kiindulási IP4, IP5 és/vagy IP6 kémiai hidrolízise. 3) Kémiai szintézis, például IP1, IP2 vagy inozit kiindulási anyagokból, 4) Enzimatikus szintézis, például inozit, IPlt IP2 és foszfát kiindulási anyagokból, 5) Mikrobiológiai eljárás, beleértve például a DNS-hibridizációs technikát is, 6) Inozit-foszfát kémiai vagy enzimatikus migrációja vagy a szubsztituált inozit-foszfát-vegyületek kémiai vagy enzimatikus hidrolízise, vagy a fenti eljárások kombinációja. Mindazonáltal, ezen eljárások alkalmazásával csak az izomerek keverékét lehet előállítani, amelyek elválasztása. ha egyáltalán lehetséges, igen nehéz. A találmány szerinti eljárásnál kiindulási anyagként előnyösen IP6 tartalmú anyagot használunk, amelyet enzimatikus úton, fitáz-enzim alkalmazásával alakítunk ÍP3 vegyületté. A fitáz-enzim általában minden inozit-foszfát-tartalmú növényben és magban jelen van. Ennélfogva, ha a találmány szerinti eljárásnál kiindulási anyagként természetes eredetű anyagot alkalmazunk, külön fitáz-enzim adagolása nem szükséges. Ha azonban a kiindulási anyag enzimatikus aktivitása kicsi vagy ha kiindulási anyagként IP6, IPS vagy IP4 vagy ezek keveréke kerül felhasználásra, például korpából származó fitáz-enzimet adagolunk a reakciórendszerbe. A találmány szerinti eljárásnál alkalmazott, növényekből, magokból vagy mikoorganizmusokból nyert fitáz-enzim meglepetésszerűen lehetővé teszi, hogy a fenti IP3 izomereket nagy koncentrációban és lényegében tiszta formában állítsuk elő. Az IP6 vegyületeket vagy tiszta formában, vagy IP6 tartalmú anyag formájában alkalmazzuk. A természetes eredetű kiindulási anyag — például korpa — esetében az anyagot előkezeljük, amely során a külső membránt szétroncsoljuk vagy eltávolítjuk, valamint eltávolítjuk az egyéb nemkívánatos alkotókat is. Ezután az anyagot vízzel itatjuk át részben az inozit-foszfát hozzáférhetőségének biztosítására, részben pedig az enzim aktiválására. Amennyiben enzim-pótlás szükséges, azt végezhetjük ebben a lépésben, de adagolhatjuk később is. Ezután az enzimatikus reakciót addig tartjuk fent, ameddig a kívánt mértékű hidrolízis végbemegy. A hidrolízist általában 20—70, előnyösen 30— 60°C hőmérsékleten 4-8 közötti pH-tartományban végezzük. Ha a hidrolízis a kívánt mértékben végbement, a reakciót a hidrolizált kiindulási anyag szétroncsolásával vagy az enzim dezaktiválásával, például gyors hűtéssel állítjuk meg. A kapott anyagot fagyasztva, szárítva tároljuk. A találmány szerinti eljárást különösen D-mio-inozit-l,2,6-trifoszfát. D-mio-inozit-1,2,5-trifoszfát, L-mio-inozit-1.3,4-trifoszfát és mio-inozit-l,2,3-trifoszfát 1P3 izomerek sav- vagy só-formáinak előállítására alkalmazzuk, amely eljárásnál az IP6 tartalmú anyagot 20-70, előnyösen 30-50°C hőmérséklettartományban 4 és 8 közötti pH értéken fitáz-enzim jelenlétében addig inkubáljuk, amíg a teljes észtermennyiség 30—60, előnyösen 50%-os felszabadulását elérjük. Az IP6 tartalmú kündulási anyag IP3 izomerré vagy izomerekké való hidrolízise ennél az értéknél a legnagyobb. A kapott inozit-foszfát-keveréket ezután oszlopkromatográfiával választjuk szét a kívánt IP3-frakciókra. A kapott frakciókat adott esetben egy további kromatográfiás, előnyösen oszlopkromatográfiás elválasztásnak vetjük alá. Ennek akkor van előnye, ha a frakció több különböző IP3 izomert tartalmaz. Az IP3 izomert vagy izomereket előnyösen sav-formában izoláljuk, majd kívánt esetben bázis hozzáadásával állítjuk elő a sót. A különböző fitáz-enzim-források közül előnyösen élesztőt, még előnyösebben pék-élesztőt alkalmazunk. A találmány szerinti eljárásnál igen előnyösek a Jastbolaget, svéd, a Rajamaki finn és a Hefefabriken AG. svájci élesztőgyártmáijyok. Ezek alkalmazásával meglepetésszerűen azt tapasztaltuk, hogy csak egy. nevezetesen a D-mio-ínozit-1,2,6-trifoszfát képződik. Ezért ezek az élesztők igen értékesek, ha csak ez az izomer az előállítani kívánt termék. Más eljárás szerint eddig még nem sikerült egyetlen izomert előállítani. A fenti eljárást alkalmazzuk bizonyos módosításokkal, ha a kiindulási anyag egy vagy több IP6, IP5 vagy IP4 vegyület. A találmány szerinti eljárás egy előnyös megvalósítási formájánál, a D-mio-inozit-l,2,6-trifoszfátot és legalább egy D-mio-inozit-1,2,5-trifoszfátot, L-mio-inozit-1.3,4-trifoszfátot vagy mio-inozit-1,2,3- -trifoszfátot tartalmazó kompozíciót állítunk elő sav- vagy só formában. A kompozícióban az IP3 vegyületek mennyisége 20—99,5. előnyösen 30—99,5 t% és a D-mio-inozit-1 2,6-trifoszfát mennyisége 50—100 t% az inozit-trifoszfátok teljes mennyiségére számolva. A maradék IP3-tól eltérő. Esetenként előnyös, ha a kompozíció egyedül D-mio-inozit-l,2.6-trifoszfátot tartalmaz IP3 vegyületként. Az inozit-foszfát kompozícióban az IP3-tól eltérő maradék lehet inozit-tetrafoszfát (IP4) vagy inozit-difoszfát (IP2). A találmány szerinti eljárással előállított kompozíció 20-99 t%, előnyösen több, mint 60 t%-ban •> tartalmaz IP3 vegyületeket és 80—0,5 t%, előnyösen kevesebb minf40 t%-ban más inozit-foszfát vegyületet Az IP3-tól eltérő inozit-foszfát-vegyületek 40— 85 t%, előnyösen 50-85 t% mennyiségben tartalmaznak IP2 + IP4 vegyületeket. Előnyös, ha az IP3 tisztán D-mio-inozit-1,2,6-trifoszfát. A kompozíció esetenként a teljes inozit-foszfát mennyiségre számított, kismennyiségű, például 10 t%nál kevesebb előnyösen 1-8 t% egy vagy több IP2 és IP6 vegyületet is tartalmazhat. Ilyen kompozíciókat úgy állítunk elő, hogy a kezdeti fermentációs inozit-foszfát termékhez a kívánt koncentrációban D-mio-inozit-1,2,6-trifoszfátot ada. gólunk. Az adagolást ismert módon, például keveréssel végezzük. Más módszer szerint a kompozíciókat úgy is előállíthatjuk, ha a fermentációnál élesztőt, előnyösen pékélesztőt alkalmazunk fitáz-enzim-forrásként. Mint az előzőekben már említettük, a pékélesztő alkalmazásával majdnem kizárólag D-mio-inozit-1 2.6-trifoszfát keletkezik. A találmány szerinti eljárással előállított inozit-trifoszfát vegyületeket akár sav-, akár só-formájukban felhasználhatjuk, gyógyszerkészítmények hatóanyagaként, továbbá élelmiszereknél adalékként vagy adott esetben különböző egyéb termékeknél stabili-196 077 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3
