195979. lajstromszámú szabadalom • Eljárás antraciklin származékok és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
13 195979 14 nyitjuk (A-frakció). A vizes fázist tömény nátrium-hidroxid-oldattal pH 7,5-re állítjuk, 4-4 liter etil-acetáttal 3x extraháljuk, és az egyesített etil-acetétos fázisokat vákuumban bepároljuk. Mélyvörös szilárd maradékot (B-frakció) kapunk 1,98 g mennyiségben. c) Az elkülönítés további menete az I-III. szemléltető táblából látható. A J-citorodint, például az oszlopkromatográfiával kapott, félig tiszta As-frakcióból nyerjük preparatív vékonyrétegkromatográfiával. Az A-, B-, C-, D-, E-, F-citorodint, valamint a G- és I-citorodin 1:1 arányú elegyét a glikozidokban feldúsult frakcióból nyerjük (III. szemléltető tábla), például ismételt kromatogréfiával Kieselgélen vagy Sephedexen (LH 20) vagy fordított fázisú (reversed phase) adszorbenseken vagy DCCC-n (droplet counter current chromatography), vagy pedig toluol és vizes metanol 1:1 arányú elegyével végzett elosztással. A tisztítás utolsó lépcsőjében preparatív vékonyrétegkromatográfiét és nagynyomású folyadékkromatogréfiát alkalmazunk. Az utóbbihoz Micropoir>silR (Waters) vagy Linchrosorb* Si 60 (Merck) oszlopot használunk, a mozgó fá2is összetétele: klorof or m: me tanol: ece tsav: viz: trie til—-amin=68:20:i9:2:0,01. Az átfolyási sebesség 0,5-1,5 ml/perc értéken tartjuk, a kimutatás UV-abszorpcióval étfolyási fotométerben történik, 254, 260 és 490 nm hullámhosszon. 5. példa A J-citorodin (I. képletű vegyület, ahol Rl=Rod-Rod-Rod és R2=COOCH3) azonosítása A II. szemléltető tábla szerinti módszerrel 15 mg J-citorodint izolálunk, amely 128- -130 °C-on olvad. UV-színkép (metanol): 242, 284, 492, 510, 522 és 558 nm. NMR (CDCb): (ppm): 1,1-1,22 (12H, m, 4 CHa), 1,75-2,25 (14H, m 7 -CH2-), 2,36 (2H, m, -CH2-), 3,51-3,6 (3H, m, 4’, 4”, 4’”-H), 3,7 (311, s, -COOCII3), 3,94-4,12 (311, m, 5’, 5”, 5”’-H). 4,3 (1H, s, C 10-H), 4,83-4,86 (2H, m, 1”, l'”-H), 5,28 (III, sz., C7-H), 5,45 (1H, sz., C l’-H), 7,34 (1H, d, J=8 Hz, C1H). 6. példa A-, B- és H-citorodin elkülönítése nyers elegy alakjában A tenyészléből extrahálással (lásd. I. szemléltető tábla) nyert nyers citorodin-elegy (B) frakció 1,0 g-ját 100 g 31 p Kieselgélen (Grace) kloroform, 96%-os metanol, ecetsav, víz és trietil-amin 80:5:5:1:0,01 arányú elegyével 3 cm átmérőjű, 43 cm hosszúságú üvegoszlopban kromatografáljuk. A mintát 7 ml futtató elegyben feloldjuk, az eluenssel átitatott oszlopra visszük és eluálés közben 23 ml-es frakciókat fogunk. Az antibiotikum-tartalmat vékonykromatográfiával, DC Kieselgel 60 F 254 (Merck) lemezen, kloroform, metanol, 96%-os ecetsav, viz és trietil-amin 80:10:10:2:0.01 arányú elegyével (B-rendszer) állapítjuk meg. 1-139 frakció: 238 mg a C, D, E, F, G+I vegyületek elegye 140-220 frakció: 189 mg az A, B, H, M vegyületek elegye, 221-228 frakció: 138 mg poláros termékek elegye (Y-frakció). Hasonló módon további nyers terméket dolgozunk fel oszlopkromatográfiával, és az azonos összetételű keverék-frakciókat acéloszlopban nagynyomású folyadékkromatográfiával (HPLC) tovább bontjuk. 7. példa Az A, B és H komponensek elkülönítése HPLC módszerrel 52,5 mg keverékfrakciót (A, B és H komponens) 2 ml B-rendszerben (összetétele lásd 6. példa) feloldunk, és az oldatot 2,lx x25 cm méretű acéloszlopra adjuk, amelyet nyomás alatt 40 g LichrosorbE Si 60 7 ju Merck adszorbenssel töltöttünk és a fenti mozgó fázissal kiegyensúlyoztunk. Az eluálás 5 ml/perc sebességgel történik, átfolyási szinképfotométerrel 490 nm hullámhosszon követjük, 4 ml-es frakciókat fogunk fel, és ezeket HPLC módszerrel végzett vizsgálat alapján az alábbiak szerint csoportosítjuk: frakció vegyületek A-rendszerben* mért Rf 19-22 6 mg B-citorodin 0.33 23-27 7 mg B+H+A citorodin keveréke 0.3 28-37 15 mg A-citorodin 0.27 *A-rendszer: kloroform-metanol-jégecet-viz 80:10:10:2 arányú elegye A H-citorodin kinyerése céljából több keverékfrakciót egyesítünk és újból kromatograf álunk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 8
