195979. lajstromszámú szabadalom • Eljárás antraciklin származékok és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
5 195979 6 mérsékleten, aerób körülmények között végezzük szénforrést és nitrogénforrást, valamint szervetlen tépsókat és nyomelemeket tartalmazó tápközeg felhasználásával. A hatóanyagokat ismert módon különítjük el a mi- 5 céliumból és a tenyészléból. Szénforrásként glükózt, keményítőt, dextrint vagy glicerint, nitrogénforrásként szójalisztet, élesztőkivonatot, húskivonatot, malátakivonatot, kukoricalekvárt, peptont 10 vagy kazeint használunk. Szervetlen tápsóként például nátrium-klorid, magnézium-szulfát vagy kalcium-karbonát, nyomelemként vas, magnézium, réz, cink, kobalt jöhet számításba. 15 Az Y-ll 472 sz. Streptomyces törzset 24-40 °C-on 6,5 és 8,5 közötti pH-érték mellett tenyésztjük. Előnyös, ha a fermentálást aerób körülmények mellett, 7,0 pH-n és 30 °C-os hőmérsékleten végezzük. A legna- 20 gyobb hozam elérésekor (72. órában) a fermentálást félbeszakitjuk. A fermentálást előnyösen süllyesztett fermentálásként valósítjuk meg. A fermentáció előrehaladását és az ant- 25 raciklin-vegyületek képződését a tenyészlé S. aureus 209 P, illetve Bac. subtilis teszttörzsekkel szemben mutatott baktérium elleni hatása alapján, vagy pedig a teljes tenyészoldat (micélium és szűrlet) szerves oldószer- 50 rel végzett extrahálása és a vörös vegyület 494 nm-nél mért abszorpciós intenzitása alapján ellenőrizhetjük. Serves oldószerként előnyösen etil-acetátot alkalmazunk. A tenyészlé szűrletéből és a micéliumból 35 az antraciklin-vegyületeket az I. szemléltető táblában mutatott módon izoláljuk. A micéliumból az antraciklin-vegyületeket szerves oldószerrel, előnyösen 3,5 pH-értékre beállított vizes acetonnal extraháljuk. 40 Az aceton eltávolítása után a vizes fázis pH-értékét 7,5-re állítjuk, és az oldatot etil-acetáttal extraháljuk. A szűrletből az antibiotikumot szintén szerves oldószerrel, így etil-acetáttal vagy 45 kloroformmal, előnyösen azonban etil-acetáttal 7,5 pH mellett végzett extrahálással nyerjük ki. A szűrletből, illetve a micéliumból nyert etil-acetátos extraktumokat külön-külön, de egyesítve is feldolgozhatjuk. Felfolgozásuk 53 sorén az extraktumot betöményítjük, a maradékot szerves oldószerben, így benzolban vagy, előnyösen toluolban feloldjuk, és az oldatot 3,5 pH-jú acetát-pufferrel extraháljuk. A feldolgozásnak ezen a pontján az ant- 55 raciklin-vegyületek elegyét két részre osztjuk: a toluolos fázisban maradó anyagok az A frakciót alkotják, míg a vizes fázisban lévő glikozid-elegy a B-frakciót képezi. Az A-frakciót a II. szemléltető táblán 50 feltüntetett módon tisztítjuk tovább. A B-frakció tisztításét a III. szemléltető táblán mutatjuk be. Ahogy a II. szemléltető tábla mutatja, az A-frakció legalább 4 komponenst ad; ezek 55 közül a J-citrodin komponens többlépcsős kromatográfiával feldúsul, végül tiszta anyagként nyerjük ki. A III. szemléltető tábla a B-frakció feldolgozását mutatja. A B-frakcióból az A-, B-, C—, D-, E- és F-citorodint, a G- és I-citorodin 1:1 arányú elegyét, a H-, L- és M-komponenst az N- és 0-citorodin elegyét, valamint a P-, V- és W-citorodint nyerjük ki. Az X- és Y-jelű frakció más antraciklin-vegyületekből tevődik össze; szerkezetüknek szintén az (I) általános képlet felel meg, megvizsgálásuk folyamatban van. Az Y-ll 472 sz. Streptomyces törzs tenyészléból elkülönített, az I. szemléltető tábla szerint tisztított vegyületek az (I) általános képletnek felelnek meg. I. Szemléltető tábla: az antibiotikum-komplex elkülönítése a Streptomyces Y-ll 472 fermentált tenyészetéből Fermentált tenyészlé Micélium I acetonnal és ac etátp uf f e r r el (pH 3,5) 2 I pH 7,5-re szűrlet beállitása órán át keverni II besűríteni, majd pH 7,5 mellett etil-acetáttal extrahální II etil-acetáttal extrahélni vizes etil-acetátos vizes fázis fázis fázis szárazra párolva nyers maradék I toluolban oldva, II acetátpufferrel (pH 3,5) extrahólva toluolos fázis vizes fázis A) frakció B) frakció II. Szemléltető tábla: az A) frakció tisztítása Nyers A) frakció (5 g) Kieselgél-oszlop 2.8x68 cm (175 g) 2% CHaOH-t tartalmazó CHCb I I--------------------1--------------------[ Ai frak- ki frak- A3 frak- Aj frakció ció ció ció 4
