195970. lajstromszámú szabadalom • Eljárás digitális lanata glikozidjainak elválasztására és meghatározására
10 195970 11 1. példa Digitalis lanata levelek lanatozid C tartalmának meghatározása 5 al) Metanoloe extrahálás: A növényi levelekből metanolban 10%-os szárazanyagtartalmú homogenizátumot készítettünk. A friss leveleket turmix készülékben (3 perc, 10 000 ford/perc) homogenizáltuk, a szárított leveleket kávédarálón megőröltük, A gyors extrakció biztosítására a homogenizátumot Vortex típusú rázógépen kétszer 30 mp-ig kezeltük. (Ez a szükséges és elégséges idő a teljes extrakcióhoz, mivel hasonló eredményi kaptunk, ha a homogenizátumot hosszabb ideig „Vortexeztük ”, illetőleg 16 órán ét rázógépben rázattuk). A mintákat 20 percig 10 000 g-vel centrifugáltuk. A felülúszó akár közvetlenül, akár az aktuális eluenssel hígítva kromatografálható. Az extrakció hatásosságát a kővetkezőképpen igazoltuk:- vékonyréteg-kromatográfiás módszerrel vizsgálva a homogenizátum és a felülúszó lanatozid C tartalmát, azonosnak adódott;- az eredeti térfogatra visszahígitott csapadékot újra Vortexxel kezeltük, centrifugáltuk, majd a felülúszó lanatozid C tartalmát HPLC-n meghatároztuk. A minta lanatozid C tartalma nem volt nagyobb, mint az eredeti csapadék térfogaténak megfelelő mennyiség. a2) Vizes extrahálás A metanoloe extrahálással azonos körülmények között végeztük a vizes extrahálást is, amely elkerülhetetlen a glikozidok enzimatikus átalakulásának vizsgálatakor. Bár a vizes extrakció legalább olyan effektiv, mint a metanolos (4. ábra), külön problémát jelent az oldatok fehérjementesitése. Ezt Amicon HM 10 membránon való ultraszűréssel végeztük. Mivel az Amicon membrán megköthet szteroidokat, ki kellett zárnunk ennek lehetőségét. E célból, ismert koncentrációjú glikozid-oldatokat szűrés előtt és után kromatografáltunk HPLC-n. Azt tapasztaltuk, hogy a megfelelő 10 minták azonos jelet adtak a kromatogrammon, azaz a szűrés nem okozott anyagveszléséget. b) Az extraktum lanatozid C tartalmának 15 meghatározása A metanolos extraktum oldható fehérjéktől gyakorlatilag mentes, azonban igen sokféle, - általunk nem vizsgált - glikozidot és 20 egyéb kromofór anyagot tartalmaz. Vizsgálataink Bzerint ezek túlnyomó része eléggé poláros, igy azok a kizárási térfogatban illetőleg közvetlenül azt követően eh iálódnak az általunk használt oldószer-ele^ gyekben (2. táblázat). Az acetonitril-viz (1:2) elegye alkalmasnak bizonyult az extraktum lanatozid C tartalmának meghatározására (4/A ábra). A 4. ábra egy un. enzim-aktív drog 10%-os szárazanyagtartalmú ötszörösen higítO'.t metanolos extraktuménak a LiChrosorb Rp-Cis oszlopon kapott elúciós képét mutatja Eluensként acetonitrihviz = 1:2 arányú eligyét alkalmaztuk, az egyéb körülmények az 1. ábrával azonosak. AzonoB körülmények között kontroll lanatozid C-t kromatografáltunk, és a kapott retencióa idő (t» = 5,0 perc) alapján azonositottuk és kvantitative meghatároztuk az extraktum lanatozid C tartalmát, amely 0,16 ± 0,01% a minta szárazár yag tartalmára számolva (3. táblázat). Ez az érték nagyobb a hagyományos, rí tinszerűen alkalmazott etilacetátos extraktumból meghatározottnál (3. táblázat; 4/B ábra). 3. táblázat Lanatozid C tartalom meghatározása növényi extraktumból [40 °C-on szárított Digitális lanata (10% szárazanyagtartalmú) drog extrahálása] Oszlop tipusa Bluens Extrahálós Retenciés idő (perc) Lanatozid C .................. (<r/\ szárazanyag LiChrosorb Acetonitril-viz Metanol 5.0 0.16 ± 0.01 (1:2) Etilacetát 5.0 0.11 ± 0.01 Dimesil Metanol-víz Metanol 7.6 0.16 ± 0.01 (59:41) Etilacetát 7.6 0.11 ± 0.01 Metanolos és vizes extrahálás: 2 x 30 sec Vortex-ezés; etilacetátos: hagyományos módszer Elválasztás körülményeit lásd a 2. táblázatban. 7
