195970. lajstromszámú szabadalom • Eljárás digitális lanata glikozidjainak elválasztására és meghatározására
12 19:1970 13 A 3. táblázat mutatja, hogy Dimesil oszlopon metanol-víz rendszert használva eluensként a lanatozid C tartalom azonosnak adódott a LiChrosorb oszlopon meghatározott értékkel, annak ellenére, hogy az utóbbi rendszerben a retenciós idő lényegesen nagyobb. Ennek alapján arra következtettünk, hogy az extraktum kromatogrammján megjelenő. lanatozid C-vel azonosítható csúcs nagytisztaságú, homogén termék. Megállapítható továbbá, hogy a sokkal olcsóbb metanol-víz elegy eluensként való alkalmazása - bár hoBBzabb ideig tartó elválasztást igényel - alkalmas Digitalis lanata extraktum lanatozid G tartalmának kvantitatív meghatározására és tiBZta formában való izolálására. 2. példa Mikrohullámmal kezelt levelek lanatozid C tartalmának meghatározása, ill, kinyerése A vizes homogenizátumban a körülményektől függő mértékben a primer glikozidok enzimatikus folyamatok révén intermedier-, illetve szekunder termékké alakulnak át. Ebben az esetben az extraktum aktuális lanatozid C koncentrációja természetesen lecsökken. A lanatozid C tartalom maximális szinten tartása elérhető a levelek mikrohullámmal történő besugárzása révén. Vizsgálataink szerint a mikrohullámú kezelés során az oldható fehérjék mennyisége minimálisra csökken, Így a kromatografálás előtt való eltávolításukra nem kell külön gondot fordítani, Bzükség esetén közvetlenül felvihető az oszlopra az extraktum. Az 5. ábra egy mikrohullámmal kezelt levélminta vizes extraktumának kromatogrammját és egyben kinyerését mutatja reverz fázisú HPLC-n. Eluensként acetonitril:víz = 1:2 arányú elegyét alkalmaztuk. Az egyéb körülmények a 2. ábráéval azonosak. A kromatogrammon a lanatozid C-nek megfelelő csúcs könnyen azonosítható, meglehetősen jól elváló csúcsként jelentkezik. Lényegesnek tartjuk megjegyezni, hogy a vizes extrakturaban épp úgy nem mutatható ki digoxin, mint a metanolon exlraktumban, tehát enzimatikuB átalakulás valóban nem következhetett be a mikrohullámmal kezelt mintában. A kroniatogramm szerint a vizes extrahálós legalább olyan hatékony, mint a metanolos, legalább is a mikrohullámmal besugárzott levelek esetében. A lanatozid C-t tartalmazó frakcióból a glikozidot ismert módon nyerjük ki. 3. példa Nagytisztaságú digoxin előállítása un. „nyers digoxin "-bői E példában bemutatjuk, hogy a találmány szerinti eljárás nemcsak a Digitális lanata levelek glikozidjainak elválasztására illetőleg meghatározására alkalmas, hanem az un. „nyers digoxin" tisztítására is. A kromatografólós eredményét a 6. ábra mutatja be. A HPLC körülményei: azonosak az 1. ábránál ismertetettel, kivételt képez az eluens, amely ebben az esetben acetonitrikvíz = 1:2 arányú elegye. Az ábrából megállapítható, hogy a termék fő komponensként digoxint tartalmaz, melyet azonos körülmények között kromatografólt kontroll digoxin alapján azonosítottunk. Megállapítottuk, hogy a gyógyszerkönyvi előírásoknak megfelelő kristályos, „tiszta” digoxin ia tartalmaz szennyezésként (kb. 3%) dezacetil-lanatozid C-t. A „glikozidkeverék” 39 ± 0,5% digoxint tartalmaz, amely könnyen és hatásosan elválasztható a jelentős mennnyiségben előforduló szennyező anyagoktól. A feloldási tényező a digoxinra nagyobb, mint 1,0, tehát a módszerrel izolálható tennék homogén. A digoxint tartalmazó frakcióból a hatóanyagot ismert módon nyerjük ki. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás a Digitalis lanata glikozidjainak elválasztására és/vagy meghatározására nagynyomású folyadékkromatográfiás módszerrel RP-Cia típusú reverzfázisú oszlopon, azzal jellemezve, hogy a) a növényi levelet vízben vagy kis szénatomszámú alkanolban, előnyösen metanolban szuszpendáljuk, a szuszpenziót nagy fordulatszámú őrlőberendezésben megőröljük, a kapott szuszpenziót erőteljesen rázatjuk, majd kívánt esetben a szilárd növényi mátrixot és fehérjéket eltávolítjuk, vagy b) a nyers glikozid-keveréket vízben, vagy kis szénatomszámú alkanolban, előnyösen metanolban oldjuk, majd a kapott felülúszót vagy a nyers glikozidkeverék oldatát RP-Cis típusú reverzfázisú oszlopon nagynyomású folyadékkromatográfon választjuk el,' és kivánt esetben a glikozidokat az egyeB frakciókból ismert módon kinyerjük. 2. Eljárás nyers glikozid-keverék tiszta formában történő elválasztására, azzal jellemezve, hogy a nyers glikozid-keveréket víz-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 6C 8
