195970. lajstromszámú szabadalom • Eljárás digitális lanata glikozidjainak elválasztására és meghatározására
6 195970 7 pont Enzimológiai Intézetének termesztése, illetve Richter Gedeon Vegyészeti Gyér Rt., un. enzimaktív Digitalis lanata levele), Oldószerek: HPLC tisztaságnak (Merck, Darmstadt, NSZK). A találmány értelmében a Digitalis lanata levelét első lépésben felaprítjuk. Az aprítást a levél állapotától függően eltérő módon és berendezésben végezzük: friss (nem szárított) levél esetében például turmix-készüléket, szárított levél esetében szárazőrlő berendezést - laboratóriumi méretben például egyszerű kévédarálót - használhatunk. Az aprítást követően egy oldószerben mintegy 10-15%-os homogenizátumot készítünk. Oldószerként vizet, kis szénatomszámú alkanolt - mint például metanolt, etanolt, stb. - használhatunk. A homogenizátumot ezt követően igen erőteljesen rázatjuk, miközben az extrakció végbemegy. Előnyös rázóberendezés például a Vortex-genie (a Scientific Industries, len., USA), természetesen egyéb intenzív extraktor ugyanúgy alkalmas e művelet végrehajtására, a rázatás ideje a rázógép intenzitásának függvénye. Az előbb említett berendezésben 0,5-1,0 perc is elegendő a teljes extrakció elérésére, ezzel szemben egy „klasszikus" laboratóriumi rázógépen 16 órára van szükség. Az extrakciót követően a növényi mátrixot eltávolítjuk. Az elválasztást célszerűen centrifugálással végezzük, előnyösen mintegy 10.000 g mellett. A felülúszó önmagában is kromatografálásra alkalmas, kívánt esetben azonban az oldat polaritásának kedvező irányban történő megváltoztatására az aktuális (a kromatografáláBnál alkalmazott) eluenssel hígíthatjuk. Találmányunk egy előnyös foganatositási módja szerint a növényi mátrix és egyéb ballasztanyagok külön eltávolítására nincs szükség, azaz az extraktum közvetlenül kromatografélható, tehát - adott esetben - egy művelet megtakarítható. Ily módon járhatunk el például a metanolon extrakció esetében, ha az extraktum oldható fehérjéktől mentes, vagy a mikrohullámmal kezelt Digitalis fólium vizes extrahálésál követően (T/34219 számú szabadalmi közzétételi irat), amely az oldható fehérjék mennyiségét ugyancsak a minimálisra csökkenti. Az úgynevezett enzimaktív levél vizes extraktuma esetében, amely nagyobb mennyiségű fehérjét tartalmaz valamely membránon - mint például az Amicon UM 10 -, ultraszürést iktatunk be. A HPLC-n történő lanatozid C és lanatozid A családba tartozó glikozidok elválasztását Lichrosorb RP-Cis típusú oszlopon Lszemcseméret: 10 ^um; oszlop hossz: 25 cm; belső X (továbbiakban ID): 4,5 mm; eluens: acetonitril: viz 40:60 arányú elegye; folyási sebesség 1 ml/perc; injektálás: 20^,111-es loop; detektálási hullámhossz: 230 nm] az 1.' ábrán mutatjuk be. Az 1. ábrából megállapítható, hogy- minden komponens szimmetrikus alakkal jellemezhető csúcs formájában lép ki az oszlopból,- a csúcsok az egyes glikozidok jellemzésére alkalmas, meghatározott idő eltelte után jelennek meg,- a felbontás megfelelő, még a kis retenciós idővel eluálódó glikozidok esetén is (a felbontási tényező, Rí = 2,0 a lanatozid C - digoxin párra),- a sávszélesség nő a retenciós idők növelésével az acetildigoxin cc és /> izomerjei is jól elválnak egymástól. A 2. ábra a lanatozid C család glikozidjainak kalibrációs görbéit mutatja. Az egyes glikozidok jelzése az alábbi: o = dezacetil lanatozid C t = lanatozid C . = digoxin x = oc-acetil-digoxin. A HPLC körülményei: azonosak az 1-. ábránál ismertetettekkel kivételt képez az eluens, amely ebben az esetben desztillált víz:acetonitril:metanol 58:37:5 arányú elegye. A 230 nm-nél detektált csúcsok maximum értékei a glikozid koncentrációk függvényében az origóból kiinduló egyenesekkel illeszthetők mintegy 50-szeres koncentráció tartományban. A meghatározás alsó határa 25 ng. Az alsó határt a detektor érzékenysége, valamint az eluensek 230 nm-nél jelentkező abszorpciója szabja meg. Az ismételt injektálás reprodukálhatósága kb. 1% relatív eltérés. A 2. táblázat három különböző típusú P.P-Cis oszlopon, különböző eluens rendszerekkel végzett elválasztás eredményeit foglalja össze. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 5
