195857. lajstromszámú szabadalom • Eljárás alfa-amidált peptidek vagy polipeptidek előállítására
10 195857 11 aktivitások értéke: legalább 800 md/irig fehérje, illetve legalább 400 inll/rng fehérje. 6. példa Az enzim gél-elektroforézise: a Mono 0 (pH - 8,0) kromatográ fiából származó, enzimcsúc.sol tartalmazó frakció A 220 mmólos nátrium-klorid koncontrá-í cióval eluált, 408 mU/mg fehérje aktivitású enzim-csúcsfrakció alikvot. SDS-t és 2-rnerkapto-etanolt tartalmazó pufferoldatban melegítéssel denaturáljuk, majd 10 %-os SDS-poliakrilamid gélre töltjük. A 220 mmólos nátrium-klorid koncentrációval eluált frakcióban egyetlen sávot figyelhetünk meg, amelynek molekulatömege megközelítőleg 73 000 dalton (4.ábra). 7. példa A 7300 daltonos sávot és az ee-amidáió enzim azonosságainak igazolása A fentikeben leírt kritériumok szerint tisztított, további cr-amidáló enzimkészítményekből alikvotokat vetünk alá elektroforézisnek nem-denaturáló 10%-os akrilamid-gélen. Minden egyes Lapra 50 /jI térfogatú alkivotot viszünk. Az elektroforéziás után a lapok egyikén a fehérjét ezüstfestési módszerrel detektáljuk. Az egyik lapból 3 mm szélességű csíkokat vágunk, és minden egyes üregbe 100 pl olyan keveréket helyezünk, amely Dansyl-szubszlrátumot, katalázt, aszkorbinsavat és 150 mM Tris-t (pH = 7,0) tartalmaz. Az inkubálást 16 órán át 36-37 °C hőmérsékleten állandó rázás közben végezzük. Ezt követően minden egyes üregben lévő alikvot részt elemzőnk, hogy a szubsztrátumnak amidált termékké való konverzióját megállapítsuk. Két gélcsíkban figyelhetünk meg enzimaktivitást: az enzimaktivitás együtt vándorol egy erősen festödő fehérjesávval a megfelelően festett géllapon (5. ábra). 8. példa Eljárás rekombináns humán kalcitonin - - előállítására A humán (emberi) kalcitonin 32 aminosavat tartalmazó peptidhormon, amelynek karboxil-végződésén amidált prolilcsoport van. Géntechnológiai úton olyan mikroorganizmust képeztünk, amely olyan rekombináns fúziós fehérjét termel, amely a humán kalcitoninnak megfelelő aminosav-szekvenciál. tartalmazza. A fúziós fehérje génjét úgy terveztük, hogy a humán kalcitonin szekvenciáját az siminovégződésen egy arginilcsoport, karboxil végződésén pedig egy glicilcsoport zárja be, amely egyszersmind a rekombináns fúziós fehérjét is lezárta. A humán kalcitonin-gént plazmidhoz kötöttük, és így egy megfelelő fúziós piazmidot képeztünk, majd egy mikroorganizmust ezzel a plazmiddal átalakítottunk, amivel elértük a fúzió kifejeződését. Ezt a humán kaleilonint tartalmazó fehérjét a rekombináns mik roorganizmusok lizátumából kicsapással különite'ttük el, majd a ciszteinilcsoportokat S-szulfonátokká alakítottuk, és a lizilcsopoi— tokát reverzibilisen védtük citrakonsavanhidriddel végzett reakcó útján. Mivel a humán kalcitonin nem tartalmaz arginint, a rekombináns fúziós fehérje tripszines emésztése olyan peptidet eredményez, amely a humán kalcitoninszekvenciát a karboxil-végzödésen glicinnel kiegészítve tartalmazza. Ezt a peptidet fordított fázisú nagynyomású folyadékkromatográfiával (HPCL) (6. ábra) vagy ioncserélő kromatogi-áfiával elkülönítettük, és szerkezetét aminosav- és mikroszekvenciás analízis segítségével állapítottuk meg. A peptid glicincsoportját eltávolítottuk, és az utolsó előtti helyen lévő propilcsoportot prolinamiddá alakítottuk a találmány szerinti cr-amidáló enzimkészitménnyel. Ezt a peptidet félpreparativ méretben végzett cc-amidálással, például a következő feltételek meilett állíthatjuk elő: 200-300 nanomól liofilizált peptidet (szubsztrátumot) 200 jul 150 mmólos Tris-HCL pufferoldatban (pH = 7) oldunk, amely kb. 750 pH <c-amidáló enzimkészítményt tartalmaz. Az enzimet patkány-MTC-szővetből vagy használt szövettenyészet-közegböl (patkány-MTC CA-77 sejttörzsből) veszünk. Az enzimet olyan mértékben tisztítjuk, hogy az öszszes proteolitikus aktivitást eltávolítjuk (lásd a fentiekben leírt eljárást). Ezt úgy érhetjük el, hogy az ioncserélő és a méretkizárásos kromatográfiát kombináljuk (lásd a fentiekben leírt eljárást). Ennek során a tiszta, homogén enzim nem feltétlen követelmény. Az így kapott keverékhez aszkorbinsavat és réz-szulfátot adunk olyan mennyiségben, hogy ezek végkoncentrációja megközelítőleg 3 mM, ill. 2 pM legyen. Az így kapott oldatot alaposan összekeverjük, és 37 °C hőmérsékleten 5-6 órán át inkubáljuk. A szubsztrátum általában 70-905á-os konverzióval alakul át a termékké. Ezután az S-szulfonát-csoportokat eltávolítjuk, és a rekombináns humán kalcitoniut, fordított fázisú HPLC segítségével tisztítjuk (lásd a 7. ábrát). A végterméket a fordított fázisú HPLC során kapott retenciós idővel (lásd a 8. ábrát), kvantitatív tripszines leképzéssel (szerkezetmeghatározássai) (9. ábra), aminosav-elemzéssel (I. Táblázat) és biológiai aktivitással jellemezzük (10. ábra). A rekombináns humán kalcitonin minden egyes esetben megkülönböztethetetlen volt a szúitctikus humán kalcitonintól. 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
