195857. lajstromszámú szabadalom • Eljárás alfa-amidált peptidek vagy polipeptidek előállítására
12 195857 13 A fenti eredmények igazolják, hogy a találmány szerinti eljárás során alkalmazott enzimkészítrné.ny képes egy fiziológiailag fontos szubsztrátum, például a humán kalcitoriin amidálására, amelyet rekombináns DNS módszerrel állítottunk elő, azt, amely kizárólag .L' aminosavakat tartalmaz. 9. példa A találmány szerinti eljárásnál alkalmazott készítmények specifikus aktivitásának meghatározására alkalmazott mérési rendszerek összehasonlítása A technika állása szerint ismert cc-amidáló enzimek aktivitásának meghatározására több módszert alkalmaztak. A legtöbb, ismeri módszer szerint a mérést D-Tyr-Val-Gly tripeptidnek D-Tyr-Val-amiddá történő konverziójára alapozták. E mérést kvantitatív módon radioaktiven jelzett anyaggal (125J-n-Tyr-Val-GIy) végzik, amelyet nem jelzett anyag (d-Tyr-Val-Gly) feleslegével összekeverve alkalmaznak. A jelzett anyag konverziójának mérése lehetővé teszi a nem jelzett anyagra vonatkozó extrapolációt, s így lehetővé válik az aktivitás kiszámítása.- Jóllehet ezt a mérést is alkalmaztuk, a készítmények aktivitásának meghatározását a dansvl-Tyr-Val-Glv dansyl-Tyr-Val-amiddá történő konverziójának közvetlen mérésére alapoztuk. Abból a célból, hogy lehetővé váljék a technika jelenlegi állása szerint ismert készítmények specifikus aktivitásának értelmes összehasonlítása a találmány szerinti eljárásnál alkalmazott készítmények specifikus aktivitásával, kísérleteket végeztünk a mérési rendszerek összehasonítására. A kísérleti eredményeket az alábbiakban összegeztük. I. I. Monodansyl-L-Tyr-Val-GIy Patkány-medulla tiroid-karcinómából és CA-77 sejttenyészet-közcg'éből elkülönített te-amidáló enzimkészítmény L alkalmaztunk enzimforrásként kísérleteink során. Összes kísérleteink során az alkalmazott enzimkoncentrációt állandó szinten tartottuk (ha erre vonatkozóan külön megjegyzést nem teszünk) . A monodansyl-szubsztrátumra vonatkozó reakciókörülmények az alábbiak. A reakcióelegy összetétele: 5 pl enzim, 5 p 1 30 mmólos réz-szulfát-oldat, 5 pl 20 mikromólos réz-szulfát-oldat, 5 pl 100 mg/ml-es szarvasmarha-hasnyálmirigyből eredő kataláz, 5 pl 2 nanomól szubszt.rát.umot tartalmazó oldat, 25 p 1 150 mmólos TES-oldat (pH = 7,0). A mintákat két ismétlésben készítettük, és 37 °C hőmérsékleten 10, 20, ill. 30 percig inkubáltuk. Ezután az enzimreakciót 10 pl 500 mmólos EDTA hozzáadásával leállítottuk. A szubsztrátumot és a terméket fordított fázisú HPLC alkalmazásával, HP-1090 folyadékkromatográfiás rendszer alkalmazásával elkülönítettük, és a mennyiségi meghatározást HP-3392 integrátorral végeztük. Kimutattuk, hogy a monodansyl-L-Tyr-Val-Gly-konverziója az «— -amidéit termékké az időre vonatkoztatva lineáris. II. 125 J-D-Tyr-Val-Gly A D-Tyr-Val-Gyl-t és a D-Tyr-Val-NH2-t Pierce-féle jódgyöngyök segítségével jódoztuk. A radioaktívon jelzett szubsztrátumot és terméket felhasználtuk egy szulfil-propil kationcserélő oszlop kalibrálására. 125J-D-Tyr-Val-Gly-t adtunk 650 pM D-Tyr-Val-Gly-hoz, és őzt használtuk szubsztrátumként a következő reakciókörülmények között: A reakcióelegy összetétele: 5 pl enzim, 5 pl 30 mmólos aszkorbáloldat, 5 pl 100 mg/rnl katalázt tartalmazó oldat, 5 pl 20 mikromólos réz-szulfát-oldat, 5 pl szubsztrátumoldat, amelynek végkon-CPntrqr.inja 650 pM és 25 pl 150 mmólos TES-oldat (pH = 7,0) A mintákat 37 °C hőmérsékleten 10, 20, ill. 30 percig inkubáltuk, majd a reakciót 500 mmólos EDTA hozzáadásával leállítottuk. Ezután az egész mintát 10 mmólos nátriuin-foszfát puffe.roldattal (pH = 5,2) hígítottuk, és szulfil-propil kationcserélő oszlopra vittük. A szubsztrátum nem kötődött az oszlophoz; az amidéit terméket 500 mmólos nátrium-klorid oldattal eluáltuk. A radioaktiven jelzett. szubsztrátumnak a termékké történő konverziója az időre vonatkoztatva lineárisnak adódott. IJl. D-Tyr-Val-Gly A D-Tyr-Val-Gly amidálására a fentebb dansyl- és jódozott szubsztrátumokra leírt reakciókörülményeket alkalmaztuk. A szubsztrélum koncentrációja a reakcióelegyben 650 pm volt. A szubsztrátumot és a terméket fordított fázisú HPLC-ben, HP-1090 folyadékkromatográfiás rendszer alkalmazásával, gradiens-eluálással értük el. Az oszlopról távozó eluátumot 280 nm hullámhossznál vizsgáltuk. E mérés érzékenysége sokkal kevesebb, mint a dansyl- vagy a jódozott szubsztrátumok esetében. Abból a célból, hogy ezt a kisebb mértékű érzékenységet is megfelelő módon tudjuk alkalmazni, az <r-atnidáló reakciókat hosszabb ideig végeztük, és/vagy nagyobb I 1 ) 11 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 8
