195856. lajstromszámú szabadalom • Eljárás avermektin-származékok és hatóanyagként ezen vegyületeket tartalmazó antiparazita készítmények előállítására
9 195856 10 1. példa 25-Ciklopcntil-(avermektin A2) előállítása Logaritmikus fejlődési fázisú S. avermitilis NCIB 12121 kultúrál tartalmazó szuszpenziót oltunk 3 literes lombikban lévő 600 ml tóplaljra, amely 12,0 g laktózt, 8,0 g szeszer jeszléshez használt répacukoroldatot és 3,0 élesztókivonatot tartalmaz és a keveréket 28 ®C hőmérsékleten 3 napon ót inkubáljuk. Egy inokulumot ótoltunk egy 20 literes fermentorban lévő 16 liter táptalajra, amely 640 g oldható keményítőt, 32 g ammónium-szulfátot, 16 g dikélium-hidrogén-foszfátol, 16 g nátrium-kloridot, 16 g magnézium-Hzulfát-heptahidrátot, 32 g kalcium-karbonátot, 6,4 g oldható élesztókivonatot, 0,016 g va8(Il)-8zulfát-heptahidrálot, 0,016 g cink-szulfát-heplahidrátot és 0,016 g mangán-klorid-tetrahidrátot tartalmaz (pH=7). A fermentációt 28 ®C hőmérsékleten 250 percenkénti fordulatszámú keveréssel és percenkénti 15 liter levegő bevezetésével végezzük. 24 óra elmúltával 1,6 g cilopentánkarbonsav-nátriumsót adunk hozzá, ezt 48 óra és 72 óra elmúltával ismételjük, és a fermentációt 120 órán át folytatjuk. Ezután a micéliumot szűréssel eltávolítjuk, Ő6 háromszor 7 liter 100 : 1 arányú aceton-n-sósav eleggyel extraháljuk. A kivonatot megközelítőleg 2 literre betöményitjük vákuumban, és kétszer 5 liter diklór-meténnal extraháljuk. A diklórmetános kivonatot szárazra pároljuk, és az olaj formájában kapott nyersterméket dietiléterben oldva 1 kg Bzilikagélből készült oszlopra visszük. Az oszlopot dietil-éterrel eluáljuk, és 100 ml térfogatú frakciókat veszünk. A 20.-40. frakciókat egyesítjük, és az oldószert bepároljuk, így egy részlegesen tisztított anyaghoz jutunk. E terméket metanol és víz 4 : 1 arányú elegyében oldjuk, és 50 mm x 50 cm méretű C18 Micro-Bondapac.k oszlopon Waters Prep 500 típusú nagynyomású folyadékkromatográfban kromalogragáljuk metanol és víz 4 : 1 arányú elegyével, percenkénti 100 ml áramlási sebességgel. Percenként összegyűjtjük a frakciókat. A 35.-50. frakciókat - amelyek a kívánt terméket tartalmazzák - egyesítjük, és ismételten kromalografáljuk egy C18 Zorbax ODS 21 mm x 25 cm méretű oszlopon (a Dupont cég védjegyzett terméke), az eluálást metanol és víz 4 : 1 arányú elegyével végezzük, percenkénti 9 ml áramlási sebességgel. Percenként összegyűjtjük a frakciókat. A kívánt terméket tartalmazó 58.-92. frakciókat egyesítjük, és az oldószert bepároljuk. Így a cím szerinti (I) általános képletű vegyületet kapjuk, amelyben R1 jelentése hidroxilcsoport, a 22-es és 23-as szénatomok között kettős kötést nem tartalmaz, Rs ciklopentilcsoporlot, R3 metilcsoport és R4 (a) képletű csoportot jelent. E termék fehér por, (0,065 g) op.: 150,5-151 °C. A termék szerkezetét tömegspektromelriéval és 13C-NMR színképpel igazoltuk az alábbiak Bzerinl: G y orsalom bőm bázá bob tömé g s pe k tr ome L- riát végeztünk VG Model 7070E típusú spektrométerben, amelyhez a minta Irietilénglikollal és szilárd nátrium-kloriddal készüli mátrixát alkalmaztunk. Az (M + Na)* értéket m/e 939-nél figyeltük meg (az elméleti érték 939). Elektron ütköztetéséé tömegspektrumol készíttetünk VG Model 7070F tömegspektrométerben. A fő fragmentumok m/e értékeit a kővetkezőknek találtuk: 335, 317, 275, 251, 233, 205, 181, 179, 145, 127, 113, 111, 95, és 87. A lJC-NMR szinképet Brucker Model WM-250 spektrométerrel a minta 20 mg/inl koncentrációjú CDCb-oldalóban vettük fel. A tetrametil-szilánhoz (TMS) viszonyított kémiai eltolódások ppm értékben a kővetkező adódlak: 14.1, 15.3, 17.8, 18.5, 19.9 , 20.3, 24.6, 25.9, 26.2, 29.3, 34.4 (2C), 34.7 , 36.7, 37.8, 39.8, 40.5, 41.0, 41.3; , 45.8, 56.4 , 56.6, 57.8, 67.4, 67.6, 68.0, 68.3 , 68.7, 69.9; , 70.5, 76.0, 77.6 <2C), 78.3, 79.5, 80.7 (2C), 81.8, 94.9, 98.7, 99.8, 117.7 , 118.5, 119.8, 125.0, 135.8, 136.3 , 137.8 , 140.: 1 és 173.8. 2. példa 25-Ciklopentil-(avermeklin A2) előállítása Logaritmikus szaporodási fázisú S. avermitilis ATCC 31271 kultúrát tartalmazó szuszpenziót oltunk 350 ml-es lombikban lévő 50 ml táptalajra, amely 1,0 g laktózt, 0,75 g szeszerjesztéshez használt répacukoroldatot és 0,25 g élesztókivonatot tartalmaz, (pH = 7) majd a keveréket 28 °C hőmérsékleten 3 napon ót inkubáljuk. Ebből a keverékből 4- -4 ml inokulumot 50 darab 350 ml-es lombikba oltunk, amelyek mindegyike 50 ml táptalajban 2,0 g keményítőt, 0,35 g szójalisztet és 0,25 g élesztókivonatot tartalmaz. A lombikokat 28 °C hőmérsékleten inkubáljuk. 24 óra elmúltával minden egyes lombikba 5 mg ciklopentánkarbonsav-nótriumsót adunk, és az inkubálást további 5 napon ót folytatjuk. Ezután a lombikok tartalmát egyesítjük, és a micéliuinot centrifugólóssal elkülönítjük. A micéliumlőmegel acélon és n sósav 100 : 1 arányú elegyével extraháljuk, és az acetonos kivonatot szárazra pároljuk, így 1,2 mg terméket kapunk. A kivonatot nagynyomású folyadékkromalogrófióval elemezve kimutatható, hogy az 1. példában leírt termékkel azonos terméket tartalmaz. 3. példa 25-(3-Tienil)-avermektin Az előállítása Logaritmikus szaporodási fázisban lévő S. avermitilis NCIB 12121 kultúrál tartalmazó 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
