195856. lajstromszámú szabadalom • Eljárás avermektin-származékok és hatóanyagként ezen vegyületeket tartalmazó antiparazita készítmények előállítására
11 195856 12 szuszpenziót oltunk 3 literes lombikban lévő 600 ml táptalajra, amely 12,0 g laktózt, 8,0 g szeszerjesztéshez használt répacukoroldalol és 3,0 g élesztökivonatot tartalmaz, majd 28 °C hőmérsékleten 3 napig inkubáljuk. Az így készített inokulumot 20 literes fermentorban 16 liter táptalajra oltjuk, amely 640 g oldható keményítőt, 32 g ammonium-szulfátot, 16 g dikálium-hidrogén-foszfátot, 16 g netrium-kloridot, 16 g magnézium-szulfót-heptahidrátot, 32 g kalcium-karbonátot, 6,4 g oldható élesztőkivonatot, 0,016 g vas(II)-szulfátheptahidrátot, 0,016 g cink-BZulfál-heptahidrátot és 0,016 g raangán-klorid-tetrahidrátol tartalmaz. A fermentációt 28 °C hőmérsékleten percenként 250 fordulatszámú keveréssel és percenként 15 liter levegő bevezetésével végezzük. 24 óra elmúltával 1,6 g tiofén-3- -karbonsav-nátriumsót adunk a fermentációs elegyhez, ezt 48 óra és 72 óra elmúltával megismételjük, és a fermentációt összesen 120 órán ál végezzük. Ezután a micéliumot szűréssel eltávolítjuk, és háromszor 7 liter olyan keverékkel extraháljuk, amely 100 : 1 arányban acelont és n sósavat tartalmaz. A kivonatot vákuumban körülbelül 2 literre betöményitjük, és kétszer 5 liter diklór-metánnal extraháljuk. A diklór-metános kivonatot szárazra párolva olaj formájában nyersterméket kapunk, amelyet dietil-éterben oldva 1 kg Bzilikagélből készült oszlopra viszünk. Az oszlopot dietil-éterrel eluáljuk, és 200 ml térfogatú frakciókat gyűjtünk. A 32.-45. frakciókat egyesítjük, ób az oldószert lepároljuk. így egy részlegesen tisztított termékhez jutunk, amelyet metanol és víz 3 : 1 arányú elegyében oldunk, és 50 mm x 50 cm méretű C18 Micro-Bondapack oszlopon Waters Prep 500 típusú nagynyomású folyadékkromaLográfban kromatografálunk. Az eluáláshoz a fentivel azonos oldószerkeveréket használunk, percenként 100 ml áramlási sebességgel. Percenként frakciókat gyűjtünk. A kívánt terméket tartalmazó 27.-36. frakciókat egyesítjük, és ismételten kromatografóljuk 21 mm x 25 cm méretű Zorbax ODS oszlopon (a Dupont cég véd jegyzett terméke). Az eluálást metanol és víz 3 : 1 arányú elegyével végezzük percenként 9 ml áramlási sebességgel. Percenként frakciókat gyűjtünk. A kívánt terméket tartalmazó 77-100. frakciókat egyesítjük, és az oldószert bepároljuk. így ahhoz az (I) képletű vegyülethez jutunk, amelyben Rl jelentése hidroxilcBoport, a 22- Bs és 23-as szénatomok között nincBen kettős kötés, R2 3-tientilcsoporlot, R3 metilcsoportot és R* (a) képletű csoportot jelent. E termék fehér por, (13 mg) op.: 167 °C. A termék szerkezetét Lömegspektrometriával igazoltuk az alábbiak szerint. Gyorsatombombszásos tömegspektromelriát végeztünk VG Model 7070E típusú spektrométerben, amelyhez a minta trietilénglikollal és szilárd nátrium-kloriddal készült mátrixát alkalmaztuk. Az (M + Na)* értéket m/e 953-nál figyeltük meg (az elméleti érték 953). Elek trón üt közte téses tömegspektr uniót készítettünk VG Model 7070F lömegspektrométerben. A fő fragmentumok m/e értékeit itt a kővetkezőknek találtuk: 349, 331, 275, 265, 257, 247, 237, 219, 195, 145, 127, 113, 95 és 87. 4. példa S avernútulis NC1B 12121 - 60 °C hőmérsékleten 10 térf./térf.%-os vizes glicerinoldatban tartott vegetativ sejtsuszpenziójóból 2 ml-t 50 ml táptalajra oltunk egy 300 ml-es kúpalakú lombikban. A táptalaj 1,0 g laktózt, 0,75 g szeszerjesztéshez használt répacukoroldatot és 0,25 g élesztökivonatot tartalmaz. A keveréket 28 °C hőmérsékleten 24 órán át rázás közben inkubáljuk. Az inokulumot ezután egy 3 literes lombikban lévő 600 ml térfogatú Telíti táptalajhoz adjuk, és az elegyet 28 °C hőmérsékleten 24 órán át rázás közben inkubáljuk. Az így kapott termékei felhasználjuk egy 16 literes fermenlonban lévő' 10 liter fenti táptalaj oltására, és a keveréket 28 °C hőmérsékleten 24 órán át percenként 350 fordulatszámú keveréssel és percenként 10 liter levegő bevezetésével fermentáljuk. Ebből a fermentációból származó 600 ml terméket egy 20 literes fermentorban lévő 16 liter táptalajra oltunk, amely 640 g részlegesen hidrolizált keményítőt, 32 g ammónium-szulfátot, 16 g dikálium-foszfátot, 16 g dikálium-hidrogén-foszfátot, 16 g nátriuni-kloridot, 16 g magnézium-szulfál-heptahidrátol, 32 g kalcium-karbonátot, 6,4 g oldható élesztökivonatot, 0,016 g vas (II)-szulfát-heptahidrálol, 0,016 g cink-szulfát-heptahidrálol és 0,016 g mangán-klorid-letrahidrátot, tartalmaz. A fermentációt 28 °C hőmérsékleten percenként 350 fordulatszámú keveréssel 15 liter levegő bevezetésével végezzük. 24 óra elmúltéval 1,6 g ciklobutánkarbonsav-nétriumsót adunk hozzá, ezt 48 órás, majd 72 órás inkubálás után megismételjük, és a fermentációt 120 órán ét folytatjuk. Ezután a micéliumot szűréssel eltávolítjuk, és háromszor 7 liter acetonnal extraháljuk. A kivonatot körülbelül 2 literre bepároljuk vákuumban, és kétszer 5 liter diklór-metánnal extraháljuk. A diklór-metént szárazra pároljuk, és igy olaj alakjában nyersterméket kapunk. Ezt 150 ml izooktánban felvesszük, és ezt az oldatot 95 ml metanol és 5 ml viz keverékével extraháljuk. A metanolos kivonat bepárlása után részlegesen tisztított terméket kapunk, amelyet nagynyomású folyadékkroniatográfiéval bontunk komponenseire a követezőképpen: A maradékot kis térfogatú metanolban oldjuk, éB 50 mm x 50 cm méretű Cl8 Micro-Bondapack oszlopon Waters Prep 500 típusú nagynyomású folyadék kromalográfiaban kromatografáljuk. Eluólósra metanol és viz 4 : 1 arányú elegyét használjuk, percenként 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
