195837. lajstromszámú szabadalom • Eljárás daunorubicin-hidrogén-klorid kinyerésére fermentléből
2 195837 3 A találmány tárgya javított eljárás a daunorubicin -hidrokloridnak fermenlléből történő kinyerésére és tisztítására folyadék oxlrakció és oszlop-kromatogrófia kombinált alkalmazásával. Mint ismeretes a daunorubicinl - az első, klinikai gyakorlatban is ' alkalmazott, antraciklin típusú, rákellenes antibiotikumot - a Streptomyces genushoz tartozó mikroorganizmusok fermentlevéből az 1960-as évek közepén izolálták elÓBzör egymástól függetlenül olasz, francia és szovjet kutatók (639.897 sz. ób 632.391 sz. belga szabadalmi leírások, An- Libiotiki, lí,763 /1966/). A mai napig ismertté vált izolációs és tisztítási eljárások - mivel a daunorubicinl termelő törzsek a fermentáció során a daunoroubicinhez kémiailag hasonló vegyületek egész sorát termelik - rendkívül bonyolultak és költségesek. A tiszta anyagot általában többszöri, különböző szerves oldószerekkel, végzett extrakcióval, vagy az extrakciós és szorpciÓB módszerek kombinálásával nyerik ki. Biotechnology of Industriell Antibiotics, Ed. von Damme E.J., Marcel Dekker, New York (1984) pp. 569-594; Advances in Biotechnological Processes, Vol. 3, Ed. A. Mizrahi - Al. van Wezel, Alan R. Liss. Inc., New York /1984/ pp. 141-61. (gy pl. a 639.897 sz. belga szabadalmi leírás szerint a formenllevel szűrési segédanyag jelenlétében szűrték. A daunorubicin nyersterméket, amely még erősen szennyezett volt, külön-külön vonták ki a Bzűrési segédanyaggal kevert micéliumból és a szűrt fermenlléból, több lépésben végzett n-butanolos és kloroformos extrakcióval. A nyerstermék tisztítását n-bulanol-foszfátpuffer rendszerben, ellenáramú oxtrakcióval végezték. A kitermelés a fermenllé hatóanyagára számítva 21% volt. Egy továbbfejlesztett extrakciÓB eljárás szorint (Process Biochem., 14 /1979/ 6-11) a formontlevet n-bulanollal kevertették és szűrték. A szűrlotel szétválasztották és a butanolos fázist bepárolték. A sűrítményhez n-hexánt adtak és savas vízzel extrahálták. A daunorubicint tartalmazó vizes fázist ace- Lon-toluol eleggyel mosták és n-butanollal csapták ki a nyers daunorubicin-hidrogén-klorid-ol, melyből melanol-elanol-kloroform oldószorolegyből végzett átkriatályosllással kapták u tiszta terméket. A szorpcióval kombinált extrakciós módszerek adszorbenskónl alkalmazták az Amberlite 1RC-50, gyengén savas, kationcserélő gyantát (1.551.195 sz. francia szabadalmi leírás), kationcserélő gyantát és alumínium-oxidot (632.391 sz. belga szabadalmi leírás), kationcserélő gyantái és Bzilikagélt (Folia Microbiol., 22 275-285 /1977/). Az ismert eljárások nagy hátránya a sokfajta és nagymennyiségű szorvos oldószer alkalmazású és az alacsony kitermelési hatásfok. A szerves oldószerekkel végzett munka, azon túl, hogy rendkívül költségessé teszi ezeket az eljárásokat, fokozott egészségvédelmi intézkedéseket is megkövetel, ami lóvá bbi költségnövelő tényező.. Ismeretes, hogy a daunorubicin maga is karcinogén és kardiotoxikus, Így ez is szükségessé teszi a fokozott egészségvédelmi intézkedéseket, melyek annál nehezebben oldhatók meg, minél bonyolultabb, minél több lépésből áll egy kinyerési, tisztítási technológia. Találmányunk célja, a daunorubicinl tartalmazó fermentléböl kiindulva, olyan kinyerési, tisztítási eljárÓB kidolgozása volt, amely a megfelelően tiszta késztermék előállítását az eddig ismert eljárásoknál egyszerűbben és gazdaságosabban valósítja meg. A daunorubicint tartalmazó fermentlével végzett izolációs és tisztítási kísérleteink során arra a felismerésre jutottunk, hogy a tisztítási lépések száma jelentősen csökkenthető egy olyan oszlopkromatográfiás lépés alkalmazásával, amely során adszorbenskónl megfelelő Bzemcseinéretű szilikagéll, eluáló szerként pedig hangyasavat tartalmazó kloroform-metanol oldószerelegyet használunk. A fermentlevel, vagy szűrt fermentlevet enyhén lúgos közegben n-butanollal extraháltuk. Az extraklumol vákuumban bepároltuk és a sűrítményből a hatóanyagot sósavos sója formájában leválasztottuk. Így egy erősen szennyezett, a daunorubicin mellett számos, nem azonosított antraciklin-glikozidot és oglikonl íb tartalmazó nyersterméket kaptunk. Ebből a nyerstermékből a találmányunk szerinL imerletelt módon, egyszeri oszlopkronmtográfiával, tiszta daunoribicin-hidrogén-klcridol nyertünk. A nyersterméket a lehető legkisebb mennyiségű metanolban oldottuk és egy olyan kromatográfiás oszlopra vittük, amely 0,063-0,2 nini szemesemérelű szilikagéll tartalmazott. Az elválasztás élessége szempontjából fontos, hogy ezt a szilikagéll kloroformban szuszpendúlva töltsük az oszlopba ős hogy a szuszpendáló kloroform metanolt, vagy egyéb oldószert ne tartalmazzon. Ezu in oluéló szerként 82:18:1 arányú kloroform-metnnol-hangyasav elegyet vezettünk az oszlopra és az eluátumot frakciókba szedve vékonyréteg kromatográfiásan elemeztük. Az említett körülmények biztosították, hogy a daunorubicin-hidrogén-kloridot tartalmazó frukciókat az egyéb anyagokat tartalmazó frakcióktól élesen külön válva kaptuk meg. Ezekből a frakciókból egyszeri bepárlással és kristályosítással gyógyászati célra alkalmas tisztaságú daunorubicin-hidrogén-kloridot nyertünk. \ találmány szerinti eljárással a dnunorubicin-hidrogén-klorid az eddig ismert eljárásoknál lényegesen magasabb, a fermentlé 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3
