195837. lajstromszámú szabadalom • Eljárás daunorubicin-hidrogén-klorid kinyerésére fermentléből
4 195837 5 hatóanyaglarlalmára számítva 60-62%-os kitermeléssel állítható elő. Jelen találmányunkat, ill. annak gyakorlati kiviteli módját a kővetkező példákkal szemléltetjük. 1. példa- Elemanalízis: C2iIh9N0iaHCl (Ms: 563,5) számított: talált: 0 57.50 57.10 11 5.32 5.40 N 2.48 2.51 Cl 6.30 6.36 Sheptomyces sp. 69. jelű törzs deponálási Bzóm: MNG-00334 alkalmazásával nyert fermentléhez (500 1, hatóanyag tart.: 40 ju'g/ml) szobahőmérsékleten, térfogatára számított 2% oxálsavat adagoltunk és 45 percig kevertettük. 1% szűrőperlit hozzáadása után további 30 percig kevertettük, majd a micóliumot szűréssel eltávolítottuk. A maradék hatóanyag kinyerése céljából a micéliuinot 2%-os oxálsav oldattal (100 1) kevertettük 30 percig és ismét szűrtük. Az egyesített Bzűrletek (530 1) pH-ját 40%-os NaOH oldattal 8,0-8,4 közé állítottuk, és a hatóanyagot n-butanollal (2x200 1) extraháltuk. Az n-butanolos fázist ionmentes vízzel (100 1) mostuk, pH-ját n sósavval 5,1 — -5,5 közé állítottuk és vákuumban, 45 °C-on bepároltuk. A sűrítményhez (4,5 1) térfogatára számított 2% ionmentes vizet adtunk, pH-ját 6 n BÓeavas elanollal 1,2-1,4 közé állítottuk, és 45 °C-on 3/4 térfogatra pároltuk, és 5 ®C-on, 24 órán át kristályosítottuk. A kivált nyers daunorubicin-hidrogén-kloridot (21 g, hatóanyag: 60%) szűrtük, n-butanollal mostuk és vákuumban 25 °C-on megszárítottuk. Az anyalúgot ismételten 3/4 térfogatra pároltuk és 5 °C-on, 24 órán ál kristályosítottuk. A kivált nyersterméket (7 g, hatóanyag: 58%) az előzőhöz hasonlóan szűrtük, n-butanollal mostuk ób megBzárítoltuk. Az egyesített nyersterméket (28 g) szilikagélen, oszlopkromatográfiásan tisztítottuk meg: A szilikagélt (5 1, szemcseméret: 0,063- -0,2 ram) kloroformban szuszpendáltulc és oszlopba (átmérő: magasság = 1:20) töltöttük. A nyersterméket metanolban (124 ml) oldva vittük a kloroformos szilikagélra. Ezután az oszlopra 82:18:1 térfogat arányú kloroform-raetanol-hangyasav elegyet vezetünk 800 ral/h sebességgel. Az eluátumot 800 ml-es frakciókba szedtük és azokat vékonyréteg kromatográfiásan elemeztük. Az egyfoltos, daunorubicin-hidrogén-kloridot tartalmazó frakciókat egyesítettük (12 1) és vákuumban, 35 °C-on 1/100 térfogatra pároltuk. 5 °C-on 24 órás kristályosítás után kivált daunorubicin-hidrogén-kloridot (12,5 g, kitermelés a fermentlé hatóanyagára számítva: 62%) Bzűrlük, kloroformmal mostuk és vákuumban, 25 °C-on megszárítottuk. A termék analitikai jellemzői:- Olvadáspont: 188-189 *C (bomlik)- Vékonyréteg kromatográfia: réteg: Kovasavgél 60 (katalógusszám: Merck 6724), 1%-ob oxálsav oldattal impregnálva, futtatószer: n-butanol-ecetsav-víz 4:1:5 arányú elegy felső fázisa, kifejlesztés 10 cm-re, Rí: 0,4-UV spektrum: E.1* metanolban oldva oldva Ica 233 nm 620 250 nm 440 286 nm 138 476 nm 201 494 nm 199 532 nm 115 2. példa A fermentlevet (500 1) micéliumos extra-háló berendezésben 1:0,8 arányú n-butanollal 8-8,4 pH-n (40%-os NaOH-dal lúgosítva) szűrés nélkül extraháltunk. A szerves fázist fél térfogat ionmentes vízzel mostuk. A mosott n-butanolos fázist a továbbiakban az 1. példában leírtak szerint dolgoztuk fel. A kitermelés és a termék analízisének adatai megegyeztek az 1. példa szerint kapott temékével. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. ) Eljárás gyógyászati célra alkalmas tisztaságú daunorubicin-hidrogén-klorid fermentléből történő kinyerésére, a fermentléból közvetlenül vagy szűrés után, vízzel nem elegyedő oldószerrel végzett extrakció, az extraktum bepárlása, nyerstermék leválasztása és annak kromatográfiás tisztítása útján azzal jellemezve, hogy a kromatográfiás tisztítást szilikagél adszorbenst tartalmazó oszlopon, hangyaeav kloroform-metanol eluáló szerrel végezzük, a daunorubicin-hidrogén-kloridot tartalmazó frakciókat bepároljuk, és a sűrítményből a célterméket ismert úton kinyerjük. 2. ) Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy olyan eluálószert alkalmazunk, amelyben a kloroform:metanol 80:20 - 90:10 térfogat arányú eluálószer 0,2-2 tf% mennyiségű hangyasavat tartalmaz. 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Rajz nélkül A kiadásért felel a Közgazdasági és Jogi Könyvkiadó igazgatója 4 89.919.66-4 Alföldi Nyomda Debrecen - Felelős vezető: Benkó István vezérigazgató
