195819. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 2-furil-butirolakton származékok és a fenti vegyületeket tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
15 195819 16 sége (O.D.) £ 0,1, MR-600 Dynatech mikro-ELISA leolvasóval mérve. C. Citotoxikus limfocita aktivitás mérésének módszere A limfociták citotoxikus aktivitásénak (CTL) meghatározására használt vegyeB limfocita tumortenyészet (MLTC) immunvizsgálatban vagy immunizált (érzékenyitett) egér limfocitákat, vagy a nyugvó tumort különböző fázisban hordozó DBA/2 egerekből származó limfocitákat (TDS) használunk. A vizsgálatban 51króm izotóppal jelzett L5178Y célsejteket és a fenti forrásokból származó effektorsejteket (érzékenyitett sejteket) használunk. Az effektor és célsejtek aránya a különböző kísérleti körülméyektől függően változik, és a vizsgálatot besugárzott stimulátor L5178Y sejtek jelenlétében vagy távollótóben végezhetjük. Az eredményeket a célsejtek lizisének %-ában adjuk meg, amelyet a kezelt csoporttal kapott cpm és a teljes (maximális) felszabadítás arányából számítunk ki, miután az utóbbi értékeket a spontán felszabaduló 5JCr értékkel korrigáltuk. A vizsgálatot 8 vagy 18 órás felszabadítási vizsgálatként hajthatjuk végre. A nyugvó tumoros állapotot (TDS) úgy indukáljuk, hogy egy nagy létszámú, DBA/2 egerekből álló csoportot szubkután a hasüreg közepe táján 1 x 106 életképes L 5178Y leukémiasejttel injektálunk. 10 nappal később a kapott - kb. 1 cm-eB - tumorcsomót sebészeti úton kimetsszük. Ha a sebészeti beavatkozás Bikeres, nem fejlődik több szubkután tumor a beültetés helyén. 7 nappal a kimetszés után az egereket 50 000 élő L5178Y leukémiasejttel fertőzzük, ez a dózis rendes körülmények között 100%-os valószínűséggel halálos aszcitesz tumort okoz 14 napon belül a normál DBA/2 egerekben. Az immunizált egerek az adott L5178Y dózisnál kivédik a gyorB tumornövekedést, és klinikailag tünetmentesek maradnak a provokálás után több héten át. Ezeket az egereket tekintjük nyugvó tumoros állapotban levő állatoknak. D) Rákellenes hatás vizsgálati módszere BDFi törzshöz tartozó egereknek intraperitoneálisan 106 L-1210 leukémiasejtet adunk a 0. napon. 24 órával később 7 egérből álló csoportokra osztjuk az állatokat, és az egyes csoportokat 9 napon át különböző dózisokban találmány szerinti eljárással előállított vegyületekkel kezeljük. A kísérletet a National Cancer Institute új rákellenes szerek kiszűrésére használt vizsgálati előírásai szerint végezzük, és kiszámítjuk a T/C arányt, azaz a kezelt csoport közepes túlélési idejének és a kontroll csoport közepes túlélési idejének arányát. Jelentős rákellenes hatásúnak azt a vegyületet tekintjük, amelynél a T/C arány > 1,25 (vagy 125%). A vegyületek előállítását közelebbről az alábbi 1-6. példák segítségével kívánjuk ismertetni, a korlátozás szándéka nélkül. A többi példában a vegyületek biológiai hatását mutatjuk be. 1. példa 93 g 2-metil-2,5-dimetoxi-2,5-dihidro-furánt - melyet N. Clauson-Kass és F. Lindborg Acta Chem. Scand. 1, 619 (1947) módszere szerint állítottunk elő - erőteljes keverés közben szobahőmérsékleten 75 g L-aszkorbinsav 750 ml vízzel készült oldatához adunk. A furénszérmazékot 50% feleslegben használjuk. 15-20 perc elteltével homogén oldatot kapunk. A reakció lefolyását UV-detektorrel felszerelt nagynyomású folyadékkromatográffal követjük. Az L-aszkorbinsav eredeti, 254 nm-nél 20%-os vizes metanolos oldatban mért 1,6 Rí értékű csúcsa eltűnik, és egy újabb, 5,9-6,0 Rf értékű csúcs jelenik meg 64 atmoszféra nyomáson. Egyidejűleg azt észleljük, hogy az oldat nem fogyaszt több jódot, amelyből az L-aszkorbinsav teljes átalakuláséra következtethetünk. A vizes oldatot 20 “C-on egy éjszakán át állni hagyjuk, majd fagyasztva szárítjuk. Halványsárga hab forinéjában (4) képletű 2-- (5-me t il- 2-f uril)-3-oxo-L-gulonolakton-3,6-— hemiketált kapunk. IR-spektrum (KBr): 3600-3100 (s, széles OH), 1785 (s, Lak ton, CO), 1700 (m, CO), 1610 és 1540 (W, furán CRC), *H-NMR-spektrum (aceton-ds) &: 6,57 (d, 1H), 6,20 (m, 1H), 4,87 (s, 1H), 4,63 (m, 1H), 4,25 (m, 2H), 2,22 (s, 3H); l3C-NMR-spektrum (DMSO-d6) S: 206,8; 173,0; 151,7; 148,5; 109,2; 107,0; 106,0; 87,6; 77,S; 74,7; 73,7; 13,2 ppm. Tőmegspektrum (ra/e): 269,1; 238,1; 155,0; 138,0; 109,0 (alapcsúcs); 85,0. 64,0 g (0,25 mól) fenti nyersterméket (olvadáspontja 55 °C) és 25,0 g (0,25 mól) borostyánkósavanhidridet visszafolyató hűtővel és nitrogénbevezető csővel felszerelt 1 1- -es gömblombikba mérünk. Hozzáadunk 200 ml HPLC-tisztaságú etil-acetátot és a reakcióelegyet 4 órán át visszafolyató hűtő alatt forraljuk. A homogén oldatot szobahőmérsékletre hűtjük, majd jégfürdóbe helyezzük. A kiváló fehér csapadékot leszívatjuk, és néhány ml hideg etil-acetáttal mossuk. 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 u5 9
