195819. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 2-furil-butirolakton származékok és a fenti vegyületeket tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
13 195819 14 ségek pedig az in vivo és in vitro metabolizmus, valamint az emberi és egér limfociták közötti különbségből származhatnak. Az összes kísérletben megfigyelhettük, hogy a mitogénekkel vagy specifikus antigénekkel nem stimulált kontroll tenyészetekre - amelyeket tehát nyugvó sejteknek kell tekintenünk - nem hatottak a találmány szerinti eljárással előállított vegyületek. A jelentős stimulátor vagy inhibitor hatás csak az aktív DNS-szintézist folytató - vagyis osztódásban lévő - sejtekben mutatható ki. Nyugvó tumort hordozó DBA/2 egérből nyert érzékenyitett limfociták citotoxikus limfocita aktivitására kifejtett immunmodulátor hatás vizsgálatára is végeztünk kísérleteket a találmány szerinti eljárással előállított vegyületekkel. A kísérlet során DBA/2 egérben kialakítottuk a nyugvó tumoros állapotot, majd vizsgálatuk a találmány szerinti eljárással előállított vegyületek hatásét a nyugvó tumoros állapotra. A fenti állatkísérlettel azt a gyanús nyugvó tumoros állapotot lehet modellezni, amelynek létezésére a primer tumorok látszólagos gyógyulása után évekkel a felújuló emberi mellrákok éB melanomák klinikai észleléséből következtethetünk. A. Lim foci La -s tim uláció vizsgálati módszere A vizsgálat célja, hogy a mikrokultúrákban lévő limfocitákat egy vagy több megfelelő koncentrációjú poliklonális mitogénnel kezelve a kezelést követő 72 órán belül megindítsuk a mitogenezist. Egérkísérletes modell esetén a különféle egértörzsekhez tartozó állatok lépét eltávolítjuk, a lépBejteket szabaddá tesszük és RPMI-1640 szövettenyésztésre használt tápközegben 1 x 107 sejt/ml koncentrációban szuszpendáljuk. A szuszpenziót 96 lyukú sima aljú szövettenyÓBzet-lemez lyukaiba osztjuk szét, 5,0 x 10* Bejl/lyuk koncentrációban. A találmány Bzerinti eljárással előállított vegyületek és a mitagén szerek vizsgálatát 10 párhuzamossal végezzük. A sejteket PHA-val, Con-A-val, specifikus antigénekkel vagy csak pufferrel kezeljük. Az in vitro vizsgálatokban a találmány szerinti eljárással előállított vegyületeket különböző koncentrációban adjuk a sejtekhez, kontrollként csak pufferrel kezeljük a sejteket. A mitogének ÓB/vagy vizsgálandó anyag hozzáadása után a sejteket 72 órán át inkubáljuk. A mitogénekre és/vagy vizsgálandó vegyülelre adott választ 0,01 microCi/lyuk koncentrációban alkalmazott 14C-jelzett timidinnel határozzuk meg, a negyedik napon. A jelzett limfocitasejteket arra alkalmas eszközzel összegyűjtjük és rostos papírkorongra helyezzük. A korongokat tartalmazó csövekbe szcintillációs folyadékkeveréket mérünk, és a radioaktivitást LKB-folyadékszcintillációs számlálóval (Model 1216/Rackbeta II) meghatározzuk. Az adatokat a mitogénnel stimulált csoport esetén mért percenkénti beütések száménak (cpm) és a kontroll (autogénnel nem kezelet) csoport esetén mért percenkénti beütések számának arányaként adjuk meg, és limfocita-Btimulációs indexnek (LSI) nevezzük. A találmány szerinti eljárással előállított vegyületek limfocita-stimuléló hatásának vizsgálatát különböző egértörzsekből nyert kezeletlen lépsejteken, vagy humán plazmából kapott limfocitálcon közvetlenül is elvégezhetjük. A fenti kísérletekben a találmány szerinti eljárással előállított vegyületeket in vitro, közvetlenül adjuk a lép-limfocitákhoz, majd a vizsgálatot és az eredmények értékelését a fentebb leírt módon elvégezzük. A vizsgálatokat úgy íb elvégezhetjük, hogy az egereket in vivo intraperitoneálisan kezeljük a találmány szerinti eljárással előállított vegyületekkel, több dóziBszinten, majd a lépet eltávolítjuk és a lép-limfocitákat összegyűjtők. Az így nyert sejtek poliklonáliB mitogénekre, vagy egerek immunizálására szokásosan használt specifikus antigénekre adott válaszát ezután a fentiek szerint határozzuk meg. Ebben az esetben a vizsgálandó vegyü’eteket már nem adjuk hozzá az in vitro stimuláció-vizsgálati rendszerhez. B. Másodlagos válasz vizsgálata A találmány szerinti eljárással előállitott vegyületek specifikus antigénre adott immunválaszra kifejtett hatását ügy vizsgáljuk, hogy az egereket specifikus antigénekkel - például marhaszérum-albuminnal (BSA) vagy kürtőcsiga hemocianinnal (KLH) - immunizáljuk. Az immunizálást kővetően különféle módszerekkel meghatározzuk a fenti antigénekre adott, sejtek által közvetített (humorába) ellenanyagválaszt. 1) A limfocita stimuláció vizsgálatának egyik lehetséges módja az, hogy a specifikus antigént, mint mitogén anyagot különböző koncentrációban hozzáadjuk a fentebb leírt limfocita-stimuléciós mikrotenyészethez. Az egyetlen különbség az, hogy az inkubélást a poliklonális mitogének esetén alkalmazott három nap helyett öt napon ét folytatjuk. 2) Az oldékony antigénekre - például BSA-ra vagy KLH-ra - adott ellenanyagvélaszt mikro-ELISA szilárd fázisú heterogén immunvizBgálati módszerrel is meghatározhatjuk. A vizsgálatot úgy is végrehajthatjuk, hogy mérjük az OBztályspecifikus immunoglobulinok (azaz IgG vagy IgM) mennyiségét. A BSA-ra adott humorába (ellenanyag) válasz eredményeket szilárd fázisú heterogén szendvics EL1SA mikromódszerrel határoztuk meg, 96 lyukú Immulon mikrotitrétor lemezen. A határérték a titerre az egérszérum legnagyobb hígítása volt, amelynek optikai sűrű5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 8
