195734. lajstromszámú szabadalom • Eljárás herpes simplex vírus elleni védőanyagok előállítására
15 195734 16 centrációban - a proteolitikus aktivitás kiküszöbölésére. A lizált (elroricsolt) sejteket a lombikokból kiszedtük, és a sejtnuigvuk eltávolítása végett 10 percen át 1300 ford/perc sebességgel centrifugáltuk. A citoplazmút 100000 x g-nél egy órán át centrifugáltuk. A citupkizmakivonatokat -70 “C hőmérsékleten tároltuk. 2. A HD— 1 ascites-folyadékból származó IgG tisztítása Az IgG tisztítását lényegében Montgomery és munkatársai leirása szerint végeztük [Biochemistry, 8, 1247 (19G9)]. Röviden összefoglalva: 7 ml 7,0 pH értékű, telitett amónium-szulfát oldatot lassan 7 ml térfogatú, jégfürdőben hűtött HD-1 aseites-folyadékhoz adagoltunk, 2 órán át kevertük, majd 30 percig 15000 x g-nél centrifugáltuk. A csapadékot reszuszpendáltuk 10 ml 0,01 mólos, 7,3 pH értékű foszfát-pufferban (a továbbiakban: PB), majd alapos dialízist végeztünk PB-vel szemben. Az immunglobulin további frakcíonálását Whatman DE-52-n végeztük, így 05 mg IgG-t kaptunk 7 ml ascites-folyadékból. A tisztított IgG SDS-PAGE elemzése azt mutattu, hogy csak két, Coomassie-kék festékkel szinezödö csík jelenik meg, amely megfelel az IgG 2A molekula könnyű és nehéz láncának. 3. A HD-1 immunadszorbens előállítása 2 g bróm-ciánnal aktivált Sepharose 4B-t (Pharmacia) készítettünk a következő módon: a gélt szobahőmérsékleten 1 órán át 0,001 n sósavban duzzasztottul;, utána 400 ml 0,001 n sósavval szűrve mostuk, és reszuszpendáltuk, 5 ml 0,2 mólos, 8,5 pH értékű, 1 mól nátrium-kloridot tartalmazó nátrium-karbonátot pufferoldatban. A gélszuszperizióhoz 5 ml PB-ben oldott 20 mg IgG-t adtunk. Az igy kapott elegyet 2 órán át szobahőmérsékleten kevertük, és szűrtük és utána 10 ml 1 mólos 8,0 pH értékű etanol-amin oldatban reszuszpendáltuk. Ezt az elegyet további 2 órán át kevertük, és szűrés után sorrendben 0,1 mólos, 4,0 pH értékű, 1 mól nátrium-kloridot tartalmazó nátrium-acetáttal, majd 0,1 mólos 8,0 pH értékű, 1 mól nátrium-kloridot tartalmazó nátrium-borát oldattal mostuk. Ekkor az elegyet 4 °C hőmérsékleten mosó pufferoldatlal (0,01 mól Tris, pH értéke 7,5, 0,1% NP-40, 0,5 mól nátriuin-klorid és 0,1 minői EMSE) egyensúlyoztuk (egyensúlyba hoztuk). Az aktivált Sepharoso-hoz kötődő IgG hatásossága 97%-nál nagyobb volt. A kö\ etkező példa bemutat ja a találmány szerinti gD-1 és gD-2 tisztítását, valamint az igy kapott készítmények tisztasági jellemzőit. Az összes műveleteket 4 °C hőmérsékleten végeztük. Egy tipikus kísérletünk során kiinduló anyagunl; 55 ml nem jelzett citopluzmakivonatból és 5 ml radioaktivan jelzett citoplazmakivcnuLból (100-180 mg fehérje) állt. A kivonatot 100000 x g-nél egy órán át centrifugáltuk, hozzáadtuk az immunadszorbenshez, és az oszlopon ötször átfolyattuk (reciklizáltuk). igy 60 ml folyadékot gyűjtöttünk össze. Ezt a frakciót átárantló folyadéknak (a továbbiakban: FT) nevezzük. Az oszlopot éjszakán át mosó pufferoldattal mostuk, és a gD-t 200 ml 3 mólos, 7,8 pH értékű kálium-rodaniddal eluláltuk. A kalium-rodanidos frakciót megközelítőleg 100-szorosan koncentráltuk: erre a célra a gD-1 esetében Amicon PM-30 membránt, a gD-2 esetében Amicon PF-10 membránt használtunk. A betóményített mintát kimerítően dializáltuk egy módosított lizáló (roncsoló) (a továbbiakban: ML) pufferoldattal szemben (0,01 mól 7,5 pH értékű Tris, 0,1% NP-40, 0,15 mól nátrium-klorid, 0,1 mmol PMSF). A tisztított gD mintákat -70 °C hőmérsékleten tároltuk. Ugyanezeket a tisztítási műveleteket hajtottuk végre a jelzett, nem fertőzött sejtekkel. SDS-PAGE elemzéssel megállapítottuk, hogy a gazdafehérjék az immunadszorbens oszlophoz észrevehető mértékben nem kötődtek. A gD-1 és gD-2 molekulasúlya jó egyezségben volt az előzőleg közölt értékekkel. A tisztított gD-1 és gD-2 triptikus peptidelemzését előzőleg közölt eljárással végeztük. A kapott eredmények is azt igazolták, hogy a glikoproteidek tisztasági foka nagy. Kvantitatív f!IP vizsgálatot alkalmaztunk a citoplazmás FT és kélium-rodanid frakciók gD-aktivitásának megállapítására. Ennek az eljárásnak a során egyszerű antitest-kötési módszert alkalmaztunk. Növekvő mennyiségben HD-1 IgG-t adtunk radioaktivan jelzett, tisztított gD-1 vagy gD-2 meghatározott mennyiségéhez. Az igy kapott elegyeket 37 °C-on 20 percig inkubáltuk, majd S. aureust adtunk hozzá az immunkomplexek öszszegyüjtése céljából. A komplexet mostuk, és SDS-roncsoló pufferoldatban szuszpendóltuk. Minden egyes mintát két alikvotban megvizsgáltunk a szcintillációs számlálóban, majd a minta maradékát SDS-PAGE úton elemeztük, hogy megbizonyosodjunk arról, hogy az öszszes, HD-1 által megkötött radioaktivitás a gD-vel kapcsolatos. Abból a célból, hogy az eredményeket a megkötött gD nanogramm-iiiennyiségében fejezzük ki, előbb meghatároztuk a fehérje mennyiségét a kálium-rodanidos frakcióban. A fehérje koncentrációjá-2. példa 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 9
