195734. lajstromszámú szabadalom • Eljárás herpes simplex vírus elleni védőanyagok előállítására
17 195734 18 nak detergens anyag jelenlétében való meghatározására Lowry és munkatársainak (J. Biol. Chem. 193, 265) Dulley és munkatársai által módosított [Analyt. Biochem. 61, 136 (1975)] módszerét alkalmaztuk. Ezután meghatároztuk nz eredeti mintában lévÓ, jelzett gD azon hányadát, amely triklór-ecetsavval (a továbbiakban: TCA) kicsapható volt. A HD-1 IgG-hez kötött, tisztított gD mennyiségét ezután a következő egyenlet segítségével 5 számítoltuk ki: az antitesthez kötött CPM gD összes megkötött, tisztított gD ng-ban = --------------------------—------------ x tisztított a gD TCA-val kicsapható CPM gD ng-ban részéi-e Az ig'y kapott eredmények azt mutatták, hogy a HD-1 IgG-hez kötött gD-1 vagy gD-2 mennyisége egyenesen arányos volt mind az 55 antigén, mind az antitest koncentrációjával. A mérés 25-200 ng gD-1 vagy gD-2 és 0,1- -1,0 jug HD-1 IgG tartományban lineáris volt. A fölöslegben vett antitesthez kötött maximális mennyiségű jelzett antigén mintegy 48% 20 volt a gD-1 esetében (6 kísérlet) és mintegy 53% a gD-2 esetében (4 kísérlet). Amidőn a nem kötött gD-l-et és gD-2-t SDS-PAGE segítségével elemeztük, a fehérjék mozgékonysága elektroforézis során ugyanaz volt, mint 25 a kötött glikoproteideké. További S. aureus hozzáadása a kötött gD mennyiségét nem növelte; ezzel szemben ha CP-1 elleni szérumot (ezt előzőleg leírt módszerrel állítottuk elő) adtunk a nem kötött gD-l-hez, akkor további 30 7 - 10% glikoproteidet kaptunk immunkicsapással. Ezek az eredmények valószínűsítik, hogy a HD-1 által felismert determináns részben inaktiválódhatott a gD-1 és gD-2 tisztítása során. A kvantitatív RIP meghatározás lineáris részében lévő egyenesek meredekségének (iránytangensének) felhasználásával a gD-1- -et és gD-2-t megkötő HD-1 egységet a következőképpen definiáltuk: a HD-1 mikrogrammjara eső glikoprotein nanogrammban kifejezve. E meghatározás alkalmazásával a kvantitatív RIT mérés segítségével meghatároztuk a gD aktivitást a tisztítási eljárás minden egyes frakciójában. Az így kapott eredményeket az 1. táblázatban összegeztük. Az eredmények szerint az eljárás következtében a gD-1 aktivitása 421-szeresére, a gD-2 aktivitása pedig 198-szorosára növekedett. A gD-1 hozama (a kiinduló aktivitás 35%-a) magasabb volt, mint a gD-2-é (16%). Az 1. táblázat adatai kidomborítják a magas hozamokat (150 /eg gD-1 és 82 Mg gD-2) és mindkét glíkoproteid fajlagos aktivitását. 1. TÁBLÁZAT A HSV gD-1 és gD-2 tisztítása immunadszorbens kromatográfiával A mért Citoplazma Átárandó folyadék Kálium-rodanidos paraméter frakció gD-1 gD-2 gD-1 gD-2 gD-1 gD-2 Összes fehérje (mg)* 180 100 176 99 0.150 0.082 Összes gD-egységb 1714 1364 127 129 600 222 A gD fajlagos aktivitása® 9.5 13.6 0.72 1.3 4000 2700 A fajlagos aktivitás növekvése 1 1 0.075 1.3 421 198 Az aktív gD összes menynyisége (mg)d 0.205 0.270 0.015 0.025 0.072 0.044 A gD aktivitás hozama (%) 100 100 7.4 7.5 35 16 “Lowry és munkatársai módosított módszerével határoztuk meg [J. Bioi. Chem. 193, 265; Analyt. Biochem. 64, 136 (1975)] kötött gD ng-ban bAz egység meghatározása a következő: 1 ■■ — — ; a gD-1 esetében 1 egység = 120 ng HD-1 IgG Mg-ban a gD-2 esetében 1 egység = 198 ng cEgységek száma/fehérje mg-ban dA kálium-rodanidos frakcióra kapott adatokból való meghatározás szerint az összes fehérje 48%-a gD-1 esetében és az összes fehérje 53%-a gD-2 esetében. A citoplazmás és az FT frakciók esetében feltételeztük, hogy a gD-1 és gD-2 100%-ban aktív volt. 10
