195734. lajstromszámú szabadalom • Eljárás herpes simplex vírus elleni védőanyagok előállítására
27 195734 28 — 1—n belül. Ezt a következtetést egy in vitro szintetikus kísérlet is alátámasztja, amelynek során a gD-l-re specifkus hírvivő RNS-t használtuk egy 49K fehérje képzésére, amely csak poliklón antitestekkel és az V és VII csoport monoklánjaival lépett immurireakcióba. A 49K polipeptid in vitro numbránfeldolgozisa - a szignál-tartományok törlése és szaccharidok bevitele céljából - olyan 52K glikoproteidhez vezetett, amely szintén csak poliklón antitestek és az V és VII csoport monoklór.jaival szemben fennálló reakcióképességét tartotta meg. Az a további tény, hoy egy megelőző szűrővizsgálat [Eisenberg és munkatársai J. Virol, 41, 478 (1982); és J. Virol. 41, 1099 (1982)] arra utalt, hogy a VII csoport monoklón antitestjei a típusra vonatkozóan közösek, indokolta, hogy az ezen antitestért felelős epitopot (amennyiben ez megtalálható) mint szintetikus vakcina-alkotórészt megvizsgáljuk. Megkíséreltük tehát annak a folyamatos szekvenciának a lokalizálását, amely a VII csoport monoklón antitestjével szemben fennálló reakcióképesség epitopját alkotja. A VII csoport antitestje elleni epitop elhelyezkedésének ismeretéhez hasznos információt jelentett a fentebb említett szintetikus in vitro eljárások során alkalmazott, tripszonizált membránkészitményekből eredő, membránhoz kötött fragmentumok elkülönítése. Az elkülönített fragmentumok megtartották kereszt-reaktivitásukat poliklón antitestekkel és a VII csoport antitestjeivel szemben, de elvesztették kereszt-reaktivitásukat az V csoport antitestjeivel szemben. Ez arra utalt, hogy a VII csoport epdtopjn valószínűleg a glikoproteid amino-terminálisának, és nem a karboxil-terminalisnuk a területén helyezkedik el. A VII csoport epitopjának helyére vonatkozó további információt nyújtottak e bejelentés szerzőinek régebbi, imnuinkötési vizsgálatai, amelyek megmutatták, hogy a VII csoport antitestje kötődik egy 12K fragmentumhoz, amely megmarad a gD-1 és gD-2 kimerítő, V8 proteázzal végzett emésztése során. Azt a tényt, hogy a 12K fragmentum a 38K fragmentumokon belül helyezkedik el, igazolta a két fragmentum ioncserélő kromatográfiás elemzésével kimutatott átfedés a triptikus peptidek alakulásában. (A 38K párhuzamos vizsgálatai arra utaltak, hogy a szekvencia korán kialakuló részében metionin-csopiortok vannak.) A 12K fragmentumok triptikus peptidjei között - amelyeket a gD-1 és gD-2-re vonatkozóan közösnek találták - volt egy .F'-nek jelölt fragmentum. Ez a típusra vonatkozóan közös szekvencia volt az egyetlen - definíció szerint - amely egy arginin-csoportot tartalmazott a molekula jobboldali végén, ahol a Lripszin hatására elkülönült a többi aminosavmaradéktól. Az elkülönített ,F" fragmentumok előzetes analízise azt mutatta, hogy molekulasúlya körülbelül 600, és mind prolinmind metionin-c.soportot tartalmaz. A típusra vonatkozóan közös .F‘ fragmentumnak a gD-1 és gD-2 glikoproteidekben való pontos helyét azonban mindeddig nem lehetett egyedül a Watson és munkatársai által feltételezett gD-1 szekvencia alapiján megállapítani, és ez megköt etelte az aminosavszekvenciák Igazolását mind a gD-1, mind a gD-2 közvetlen aininosavelemzése útján. A következő példa a gD-1 és gD-2-n végzett szekvenciavizsgálatokat mutatja be. 6. példa 1. A vírusok és sejtek előkészítése A KB és BHK sejtek növesztésére és fenntartására vonatkozó körülmények, valamint a HSV-1 (HF törzs) és HSV-2 (Savuge-törzs) virustörzsek előkészítésére alkalmazott eljárás, valamint a plakk-mérés a fentiekkel azonosak voltak. Fertőzés céljára 20 lemezképző egységet tartalmazó HSV-l-et vagy 10 lemezképzó egységet tartalmazó HSV-2-t alkalmaztunk egy sejtre. 2. Metabolilcus jelölés Radioaktiv meticninnal, lizinnel és argininnal való jelzés céljára egy 75 cm2 alapterületű edényt használtunk, .amelyben KB és BHK sejteket áramoltattunk, és HSV-1- vagy HSV-2-vel fertőztük. A fertőzés után 2 órával a sejteket Eagle-féle minimáltáptalajjal felülrétegeztük, ez a metionin, arginin vagy lizin normális koncentrációjának tizedrészét tartalmazta. A pulzus-jelölést a fertőzés után 6 órával végeztük úgy, hogy a fertőzött sejteket 15 percig inkubáltuk 4,5 ml Hank-sóban, mely a következő izotópok egyikét tartalmazta: 35S-metionin (fajlagos aktivitása G00 Ci/mmól, I mCi); 2,3-3H-arginin (fajlagos aktivitása 15 Ci/mmól, 1 mCi); és 4,5-3lI-lizin (fajlagos aktivitása 60-80 Ci/mmól, 1 mCi). A mono-rétegeket jéghideg sóoldattal mostuk, lizist alkalmaztunk, és a fentebb leírtak szerint citoplazmakivonatokat készítettünk. Leucinnal és alaninnal történő radioaktív jelölés céljából a fertőzött sejteket pulzus-jelölésnek vetettük alá a fertőzés után 6 órával, 15 percig Hank-sóoldatban, majd felülrétegeztük Eagle-féle minimáltáptalajjal és 37 °C hőmérsékleten további 2 órán át inkubáltuk. A következő radioizotópokat alkalmaztuk: 4,5—3H-leucin (fajlagos aktivitása 50 Ci/mmól, 1 mCi); és 3-3H-alanin (fajlagos aktivitása 75 Ci/mmól, 500 /mCi). 3. A tisztított gD jódozása A tirozin-csoportok helyzetének megállapítása céljából a gD-l-et és gD-2-t immunadszorbens kromatográfiával tisztítottuk, majd 15 Mg fehérjét Greenwood és munkatársai f> 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 15
