195734. lajstromszámú szabadalom • Eljárás herpes simplex vírus elleni védőanyagok előállítására
29 195734 30 iBlochern. J. .9.9, 111 (19C3)] kloramin-T eljárásával jódoztunk. 4. Az aminosnvszekvencia megállapítására alkalmazott minták előkészítést' Minden egyes citoplazmakivonatot CP-1 elleni szérummal imnumkicsapási reakcióba vittünk (a CP-1 elleni szérumot egerekben képeztük tisztított gD-l-vel szemben.) Az antigén-antitest komplexek összegyűjtésére Staphylococcus aureus Covan I törzset alkalmaztunk (IgSorb, New England Enzyme Center). A csapadékot mostuk, és az antigén-antitest komplexeket a fentebb leirt módon roncsoltuk. Egy vészt SDS-PAGE módszerrel elemeztünk. Szarvasmarha-szérumalbumint (100 ug) adtunk a maradékhoz, és a fehérjét 25%-os TCA-val 4 °C hőmérsékleten 17 órán át tartó kezeléssel kicsaptuk. A csapadékot 13000 x g-nél 30 percen át. végzett centrifugálissal összegyűjtöttük, 1 ml 0,1 n nátronlúgban oldottuk, kimerítően dialízáltuk desztillált vízzel szemben, majd liofilizáltuk. Ugyanígy jártunk el a jódozott gD-1 és gD-2 immunkicsapása során. 5. SDS-PAGE Az SDS-PAGE eljárást 0,4% N.N’-diallil-borkósuv-diamiddal térhálósított 10%-os akrilamid lapokon lényegében a Spear áltál leírt módszerrel végeztük [J.Vlrol. 17, 991 (1976)] Elektrcforézis után a géleket Coomassie brilliant-kékkel festettük, szűrőpapíron megszáritottuk, és Kodar XAE-5 filmre exponáltuk. G. Az aminosavszekvencia elemzése A radioaktivan jelzett gD-1 és gD-2 lépcsőzetes Edman-lebontásét egy Beckman 890 B fehérjeszekvencia-elemzöben végeztük [Edinán és munkatársai: Eur. J. Biochem. 1, 80 (1967); és Hermodson és munkatársai: Biochemistry, 11 4493 (1972)]. A radioaktivan jelzett, liofilizált mintákat vizben oldottuk, és 50 uniói cetsperma-mioglobirmal elegyítettük. Az egyes lépésekben kivett mintákat megszáritottuk, 100 pl acetonban reszuszpendáltuk, és szcintillációs csövekbe helyeztük. A csöveket további 50 pl acetonnal, majd 100 pl etil-acetáttaí mostuk, a csöveket nitrogéngázban megszáritottuk, és szcintillációs számlálással elemzést végeztünk. A125J-t tartalmazó mintákat közvetlenül egy gamma-számlálóhan elemeztük. Minden egyes kísérletben az összes jelzett és számos nem jelzett alkotórész helyét megerősítettük magas nyomású folyadékkromatográfiával, melyet a mioglobin vivőfeberjéből eredő aminosavakkal végeztünk. A gD jelölésére általában azt az eljárást használtuk, hogy a sejteket vagy HSV-l-vel vagy HSV-2-vel fertőztük, majd a sejteket az adott radioaktív aminosavval metabolikusan jelöltük. A metionin, arginin és lizin esetében a fertőzés után 6 órával végrehajtott pulzus-jelölés elegendő volt a gD szekvencia elemzését célzó radioaktiv jelzés biztosítására. Ilyen jelzési körülmények között a radioaktivitás zömét a gD-1 prekurzor formáiban (53000 dalton) és gD-2 prekurzor formáiban (52000 dalton) találtuk meg. Az alaninnak gD-1-be és leucinnak mind gD-l-be, mind gD-2-be való beágyazására további 2 órés jelzési eljárás volt szükséges, hogy a jelzett gD kielégítő mennyiségben legyen jelen. A jelzés ilyen körülményei között a glikoproteidelcnek mind a prekurzor, mind a termékformái jelzést kaptak. A jelzési időszak végén citoplazmaextraktumokat készítettünk, és tisztított gD-1 elleni poliklón antitesttel immunkicsapásba vittük. A jelölt triozin szekvencia vizsgálata céljából a fertőzött sejtek kivonataiból nyert gD-l-et és gD-2-t inununudszovbens kromatográfiával tisztítottuk, és a tisztított fehérjéket a kloramin-T eljárás útján 125J-vel jódoztuk. A radioaktivan jelölt készítmények SDS-PAGE elemzése az N-termiriális szekvencia automatikus elemzésével megmutatta, hogy ha inelabolitikus jelölést alkalmaztunk, akkor a radioaktiv jelölésnek több, mint 95%-a jelen volt a gD-1 és gD-2 prekurzor vagy termékvagy mindkét formájában. A jódozott gD-1 esetében némi jelölés a kismolekulasúlyú polipeptidekben volt megfigyelhető. Nem világos, vajon a gD-nek ezek a fragmentumai a jodozás eredményeként képződtek-e, vagy a tisztított gD-1 proteolitikus emésztésének eredményeként jöttek létre, amelyet a jódozás előtt végeztünk. A radioaktivan jelzett gD-1 és gD-2' automatizált Edman-lebontésának profiljait és az ezekből a profilokból leszármazhatott szekvenciákat az 5. táblázatban mutatjuk be; n Watson és munkatársai által a jósolt aminosavszekvenciára vonatkozó szekvenciaszámo- Uat zárójelben tüntetjük fel. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 16
