195733. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szövet plazminogén aktivátor és ezt hatónyagként tartalmazó gyógyszerkészítmény előállítására
4 195733 5 a mintegy 500.000 NE/mg fajlagos aktivitású t-PA (NE: nemzetközi egység, amelyet a WHO, National Institute for Biological Standards and Control, London állapított meg). Az előnyösen alkalmazható t-PA aminosav szekvenciája lényegében azonos az 1. ábrán adott szekvenciával, de felhasználhatók az egy vagy több aminosav elhagyásával, helyettesítésével, beépítésével, felcserélésével vagy hozzáadásával, amikoris a kapott szekvencia legalább 80%-ban, előnyösen 90%-ban azonos az 1. ábrán adott szekvenciával, és lényegében megtartja a fehérje eredeti biológiai és immunológiai tulajdonságait. Ezen belül előnyös az 1. ábrán megadott szekvenciáju t-PA, vagy az N-terminális szerintői számított 245. pozícióban metionin helyett valint tartalmazó szekvencia, valamint a fenti két szekvenciának olyan változata, amelyben az első három aminosav valamelyike hiányzik vagy az N-terminális véghez egy Gly-Arg preszekvencia kapcsolódik. Az 1. ábrán megadott aminosav szekvencia 35 cisztein maradékot tartalmaz és így 17 diszulfid-hid képzésére képes. Szerkezetileg részletesebben felderített fehérjék alapján a Asp D aszparaginsav Thr T treonin Ser S szerin Glu E glutaminsav Pro P prolin Gly G glicin Alá A alanin Cys C cisztein Val V valin Met M metion A t-PA bármely ismert eljárással előállítható. Előállítható például a Biochmica et Biophysics Acta 580, 140-153,(1979), irodalomban vagy a 41 766. vagy 113 319. számú európai közrebocsátási iratokban ismertetett normál vagy daganatos sejtvonalakból. Előnyösebb azonban, ha a t-PA-t rekombináns DNS technológia segítségével nyert transzformált sejtvonalak tenyészetéből nyerjük (például 93 619., 117 059. vagy 117 060. számú európai közrebocsátási iratokból). Különösen előnyösen alkalmazhatók kinai hörcsög petefészkéből (CHO) származó sejtek, amelyek a Molecular and Cellular Biology 5(7), 1750- 1759 (1985) által ismertetett módon nyerhetők ki. Ennek során a klónozott gént a dihídrofolát reduktázt (dhfr) kódoló génnel együtt dhfr-CHO sejtbe viszik be. A dhfr-t kifejező származékokat nukleozidmentes közegben elválasztják és a metotrexát koncentrációjának növelésére használják. A kapott dhfr és t-PA génekből stabil sejtvonal nyerhető, amelyen intenzív t-PA kifejezés érhető el. A t-PA előnyösen tisztítható bármely ismert módszerrel (Bioehimica et Biophysica 90. pozícióban lévő aminosav és a C-terminélis prolin közötti (diszulfid-hidak alapján) feltételezett szerkezetet a 2. ábra mutatja. Az N-terminélis szakasz szerkezete kevésbé felderített, annak ellenére, hogy néhány javaslat már ismert [Progress in Fibrinolysis, 6, 269-273 (1983); Proc. Natl. Acad. Sei., 81, 5355-5359 (1984)]. A t-PA szerkezetének legfontosabb része a két gyűrűvé záródó hurok (kringle) a 92. és 173. aminosav, valamint a 180. és 261. aminosav között, amely szakasz felelős a fehérje és a fibrin összekapcsolódásáért, valamint a szerin proteáz szakasz, amely magába foglalja a B lánc legnagyobb részét és amely felelős a plazminogén aktiválásáért. A szerin proteáz legfontosabb sav -komponensei a katalitikus hatású His/Asp/Ser hármas csoport. A t-PA-ban ez a 322., 371. és 463. pozícióban jelenik meg. A 264. és 395. cisztein savmaradék közötti diszulfid-híd szintén nagyon fontos, mivel a t-PA kettős láncú szerkezetében ez tartja össze az A- és B-láncot. Az 1. és 2. ábrán az alábbi ismert egy és három betűs kóddal jelöltük az aminosav-maradékokat: He I izoleucin Leu L leucin Tyr Y tirozin Phe F fenilalanin His H hisztidin Lys K lizin Arg R arginin Trp W triptofán Gin Q glut&min Asn N aszparagin Acta, 580, 140-153 (1979); J.Biol. Chem. 254(6), 1998-2003 (1979); J. Bioi. Chem. 256(13), 7035-7041 (1981); Eur. J. Biochem. 132, 681-686 (1983); 41 766. és 113 319. számú európai közrebocsátási h'atok, valamint 2 122 219. számú angol közzétételi irat). A találmány szerinti eljárással a t-PA felső oldódási határ nélkül oldható vízben. Nagy koncentrációk esetén, igy 150 000 NE/ml feletti koncentrációknál erősen viszkózus oldatot kapunk t-PA kiválás nélkül. A t-PA koncentrációja tehát a vizes oldatban széles határok között, például 50 000- -50 000 000 NE/ml között változtatható. A találmány nyújtotta előnyök kihasználásához célszerű, ha a t-PA koncentrációja nagyobb mint 100 000 NE/ml, előnyösen 500 000 NE/ml, különösen előnyösen nagyobb mint 1 000 000 NE/ml. A legelőnyösebb, ha a t-PA koncentrációja mintegy 5 000 000 NE/ml. A legelőnyösebb, ha a t-PA koncentrációja mintegy 5 000 000 NE/ml. A vizes oldat pH-értékének felső határa előnyösen 4,5. A pH-érték előnyösen 2,5-4,0, ezen belül 2,8-3,5, elsősorban mintegy 3,0. A 5 10 15 20 25 45 50 55 60 65 4
