195724. lajstromszámú szabadalom • Hatóanyagként új C-patotítusú Bacillus thuringiensis törzset, vagy az általa termelt toxint tartalmazó inszekticid készítmény és eljárás a hatóanyag előállítására
o 195721 A találmány tárgya hatóanyagként új, C-patotipusú Bacillus thuringiensis törzset vagy az általa termelt toxint tartalmazó inszekticid készítmény és eljárás a hatóanyag előállítására. A kémiai inszekticidek mellett több éve ismert inszekticid kutatómunkák tárgyát képezik bakteriális inszekticidek. Legelőször 1915-ben írták le a Bacillus thuringiensist (Bt), mint lisztmolylárvák elerőtelenedésének előidézőjét. A 70-es évek közepéig minden elkülönített Bt olyan patotipushoz tartozott, amelyik csak pikkelyesszárnyúak (Lepidoptera) lárvái ellen volt hatásos. Ezt a patotípust A tipusként jelölik. Ehhez tartoznak a var. thuringiensisen kívül a szintén gyakorlatilag felhasznált kurstaki és galleriae változatok. 1977-ben Goldberg és Margalit elkülönítettek a Negev-sivatagban egy szúnyogköltőhelyről származó mintából egy olyan törzset, amely különböző szúnyogalkatúak ( Némátocera) (Diptera) lárvái ellen fertőződnek bizonyult, és később Bacillus thuringiensis var. israeliensisként (Bti) osztályozták. Ezt a patotípust B típusként jelölik. Időközben ezt a változatot is hasznosították gazdaságilag. A bakteriális inszekticidek előnye abban van, hogy nagyon szelektíven bizonyos kártevő fajtákra hatnak. így például a 4.166.112 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban közölnek egy inszekticidet, amelyet a Goldberg által felfedezett Bacillus thuringiensis var. israeliensis hatóanyagként tartalmaz. Ez nagyon egyértelműen mutatja, hogy ez a baktériumtörzs szúnyoglárvák ellen milyen szelektíven fertőzőén hat, míg más szervezeteket nem is befolyásol. Igény van bakteriális inszekticidekre más kártevőcsoportok ellen is. A találmány tárgya a Bacillus thuringiensis egy új változata, amelyet Bacillus thuringiensis var. tenebrionsisként (Btt) jelölünk. Kimutatható volt, hogy ez a törzs inszekticid hatással rendelkezik mégpedig bogárfajták (Coleoptera, fedelesszárnyúak), különösen levélbogarak, például a kék égerlevelész (Agelestica alni) valamint a burgonyabogár (Leptinotarsa decemlineata) ellen. Egy új patotípusról van szó, amelyet C patotipusként jelölünk. A találmány tárgyát képező továbbá egy bakteriális inszekticid, amely hatóanyagként C patotipusú Bacillus thuringiensist, különösen Bacillus- thuringiensis var. tenebrionist vagy egy ebből nyez-hető inszekticid hatású készítményt illetve toxint tartalmaz. Az új Btt változata a közönséges lisztbogár (Tenebrió molitor L., Coleoptera : Tenebrionidae) beteg fejlődési stádiumban lévő egyedcikből különítették el. A tiszta tenyészet fenntartása 25 - 30 °C-on kémcsövekben ferde agar táptalajon történik. A típus konzerválása céljából száraz spórákat fagyasztanak. A meghatározás morfológiai és biokémiai ismertetőjegyek alapján történt. Az elkülönített baktériumok agar táptalajon nagy, egyenetlen, fehéres telepeket fejleszt, amelyek sejtjei 18 - 24 óra múlva spóráznak. A vegetatív sejt ostoros, pálcikaalakú, és mérete körülbelül 1,0 x 2 - 8 pm. Gram-pozitivan i-eagál. A spóraanyasejt az alul fekvő ellipszoidális spóra mellett (0,8 x 1,4 - 1,6 mm) egy sík, lemezalakú és parallelogramma, rombusz vagy négyzet körvonalú (körülbelül 0,8 - 1,5 pm élhosszúságú) paraspcrális kristályt tartalmaz. A vegetatív fázisban a Bacillus növekedése fakultatívan és anaerob is végbemegy. A spórázás ellenben aei’ob történik. A vegetativ sejtek növekedésére 25 - 30 °C-nál van a hőmérsékleti optimum. A 15 percig 121 °C-on végzett autoklávozás (megfelel 1 bal- túlnyomásnak) a spórákat és a kristálytoxint is teljesen inaktiválja. A spórák 254 nm-nél végzett ultraibolya besugárzással megfelelő dózisnál inaktiválódnak, a kristálytoxin azonban nem. A vegetatív sejtek biokémiai teljesítőképessége a következő. Lebontható szénhidrátokból (például glükózból) erjedési sav és acetil-metil-karbonil keletkezik, gáz azonban nem. Glükózon kívül savasodás közben mannózt és szacharózt is lebont, de laktózt, cellobiózt, szalicint, arabinózt, xilózt vagy mannitot nem. Eszkulint hidrolizál, hasonlóképpen keményítőt is. A következő enzimek mutathatók ki : kataláz, nitrát-redulctáz és proteináz. Nem mutatható viszont ki : lizin-dekarboxiláz, fenilalanin-dezamináz, ureáz és leeitináz. Laboratóriumi méretben előállítási célokra fermentlózárót használunk. Egy 250 ml-es Erlenmeyer lombikban 50 ml tápoldatot fermentálunk. A tápoldat összetétele a következő : 0,5 % élesztőkivonat, 0,5 % tripton, 0,1 % glukóz, 0,08 % kálium-dihidrogén-foszfát csapvizben, pH 7,0. Tenyésztési hőmérséklet 25 - 30 °C. A tenyészet spórázását követően, amely mikroszkóposán ellenőrizhető, a biomasszát lecentrifugáljuk és vízzel vagy pufferral kimossuk. A Btt hatása fedelesszárnyúak (Coleoptera) lárváira olyan, ahogy már az A p>atotípusról ismert : Néhány órán belül a táplálkozás megszűnik, és a dózistól függően néhány nap múlva bekövetkezik az elhullás. A toxikus hatás oka az, hogy a középbél felhámját a bélnedvben oldott kristályos toxin tartósan károsítja. A károsodott belsejtek elválnak egymástól és az alaphártyától, és a bélűrbe kerülnek. A bélfal áttörése következtében baktériuinsejtek hatolhatnak a keringési űrbe, és ott a felbomlás folyamatát halálos vérmérgezéssel befejezik. Az új Btt változat C patotípust, amelynek prototípusát egy elpusztult lisztbogár-bábból tudták elkülöníteni, a .Német Mikroorganizmus-gyűjteményben’ (Deutsche Samm-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
