195724. lajstromszámú szabadalom • Hatóanyagként új C-patotítusú Bacillus thuringiensis törzset, vagy az általa termelt toxint tartalmazó inszekticid készítmény és eljárás a hatóanyag előállítására
-1 195721 lung für Mikroorganismen) a DSM 2803 számon tették letétbe. A szerológiai vizsgálat szerint a DSM 2803 var. tenebrionsis törzs a H 8a,8b szerotipushoz tartozik. Az új Btt változat C patotípus szelektív inszekticid hatást mutat fedelesszárnyúakra, különösen a kék egérlevelészre (Agelastica alni) vagy a burgonyabogárra (Leptinotarsa decemlineata). A hatás lárvák esetében lényegesen erősebb, mint imágóknál. Semmilyen hatást nem észleltünk pikkelyesszárnyúak (Lepidoptera) ellen, például a lisztmoly (Ephestia Kühniella Zell.), Káposztamoly (Plutella xylostella L.) ellen, és kétszárnyúak (Dipteral, például a sárgalázszúnyog (Aedes aegypti L.) ellen sem. A követkető táblázatban összefoglaljuk az elvégzett biológiai vizsgálatok eredményeit. Btt toxikus hatása különböző fedelesszárnyúakra (Coleoptera), pikkelyesszárnyúakra (Lepidoptera) illetve kétszárnyúakra (Diptera). Vizsgált faj Alkalmazott dózis (spóraek vivale ns) Toxikus hatás Kék égerlevelész 10®/cm2 + Burgonyabogár 106/cm2 + Lisztmoly 2.5xl08/cm3-Káposztamoly 4xl07/cm2-Sárgalázszúnyog 5xl06/cm3 A tulajdonképpeni inszekticid hatóanyag a Bacillus thuringiensis esetében a kristályos toxin. A kristálytömeg elkülöníthető, ha a spói'ázott tenyészetekből a spórangiumok lízise után a kristályokat a sejtmaradékoktól és a spóráktól elválasztjuk, és megtisztítjuk, például sűrűséggradienssel. A Laemmli módszere [Nature 227, 680 (1970)] szerinti SDS-poliakrilamidgélelektroforézis segítségével végzett molekulatömeg meghatározásnál két fő sávot találtunk körülbelül 65000 D és körülbelül 70000 D értéknél. Kisebb, gyengébb intenzitású sávok vannak a 20000-40000 D tartományban. A találmány szerinti toxin segítségével olyan antitestek nyerhetők, amelyek Ouchterlony-féle immundiffúziós tesztben semmilyen keresztreakciót nem adnak az A vagy B patotipus más toxinjával. Inszekticidként való alkalmazás céljából a Bacillus thuringiensis var. tenebrionist vagy valamely ebből nyerhető inszekticid hatású preparátumot vagy toxint önmagában ismert módon szokásos adalékokkal (hordozók, rögzitöszerek, nedvesítőszerek, stb.) elegyítjük, és valamilyen megfelelő alkalmazási fomába alakítjuk. Az így formált inszekticid nedvesíthető por, szuszpenzió formájában, granulátumként vagy egyéb formában alkalmazható. Előnyösen valamilyen tisztított, spórázott tenyészetet használunk valamilyen ned vési tőszer, például 0,1 % Citowet 8 ■1 (BASF) hozzáadásával készített szuszpenció formájában. A kezelendő földfelületre hektáronként 1Ü12 - 1015, előnyösen 1013 - 10H sjiórát és ekvivalens számú toxikus kristályt permetezünk ki. Ilyen módon például sikerül burgonyaföldet 2-4 hétig védeni burgonyabogártól. Az egész növekedési fázis alatti védelem céljából az említett időközönként további kezelések szükségesek. A nem-eélszervezetek, például rovarevok (entomofágok) és mézelő méhek elleni hatás nem volt figyelemreméltó. Az alábbi példák kapcsán közelebbről is ismertetjük a találmány szerinti megoldást és eredményeit 1.példa. C-patotípusú Bacillus thuringiensis tenyésztése és az inszekticid toxin elkülönítése 10 g eptonból (vagy rptonból), 5 g élesztőkivonatból, 5 g nátrium-kloridból, 1000 ml-re kiegészítő desztillált vízből álló tápoldatot sterilizáltunk és C patotipusú Bacillus thuringiensis DSM 2803-mal inokuláltunk. Az inokulálási dózis egy 24 órás indulási kultúrából 0,5-1 % volt. Az inkubációs hőmérséklete 30-32 °C-ra állítottuk be, a rázógép rázósi sebessége max 200 ford/perc. A fermentáló akkor fejeződött be, amikor egy mikroszkopikus vizsgálat azt mutatta, hogy a spórangiumok több, mint 90%-a spontán lizálódott. A szabad spórák és kristályok (= spóraekvivalens) kitermelése körülbelül 1010/ ml. Az ezen tenyésztési eljárással kapott spórákat a fermentációs tápoldat 30 perc alatt 5000 g-nál végzett centrifugálásával elkülönítettük. Az üledéket vízzel mostuk és ezt követően liofilizáltuk. Annak érdekében, hogy ebből a primer termékből a toxinkristályokat elkülönítsük, a kapott üledéket mintegy 1 mg/ml koncentrációban szuszpendáltuk és 25-55 tömeg% lineáris cézium-klorid-gradiensre állítottuk be. 3 óra alatt 20000 ford/perc-nél végzett centrifugálás a spórák kristályok és sejttörmelék különböző sávokká való szétválasztásához vezetett. A 35-45 tömeg% cézium-klorid tartományú három sáv közül a középső tartalmazta a tiszta toxinkristályokat. Ezt a sávot kivettük és 50 ml vízben 15000 ford/perc-nél 30 percig kétszer centrifugáltuk, hogy a kristályokat eézium-klorid-mentesre mossuk. Ezt követően a kristályok szuszpenzióként vagy üofilizálva alkalmazhatók a továbbiakban. 2. példa C-patotipusú Bacillus thuringiensist tartalmazó inszekticid készítmény. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
