195640. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 2-(4-benzoil- 1-piperidinil)- 1-fenil-alkanolszármazékok és az ezeket a vegyületeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
13 195 640 14 A találmány szerinti vcgyülctckkcl farmakológiai próbákat hajtunk végre. Mérgezőképességüket CDI törzsű egereken határozzuk meg grafikus eljárással A legtöbb vegyület LD50 értéke (a halálos dózis 50 %-a) nagyobb I00 mg/kg-nál intrapcritoncálisan adva. A találmány szerinti vcgyülctckkel elvégezzük a teljes agyi vértelcnség (isémia) próbáját. Az isémiát a szívműködés leállása okozza, melyet MgCl2 gyors intravénás injekciójával idézünk elő. E próbában minden egérnél meghatározzuk a „túlélési időt”, vagyis a MgClj injekció beadásának pillanata és az utolsó megfigyelhető légzömozgás között eltelt időt. Ezen utolsó mozgási a központi idegrendszer működése végső jelének tekintjük. A légzés megszűnése a MgCl2 injekció után mintegy 19 másodperc múlva következik be. Hím egerek (Charles River OD1) 10-es csoportjait vizsgáljuk. Az egereket a kísérlet előtt ad libitum tápláljuk és itatjuk. A túlélési időt a találmány szerinti vegyületek intraperitoneális beadása után 10 perc múlva mérjük. Az eredményeket a kezelt 10-es egércsoport és a folyékony vivöanyagot kapott 10-es egércsoport (kontroll) túlélési idejének különbségeként adjuk meg. A túlélési idők változásának és a vegyület dózisának összefüggését féllogaritmusos görbe alapján grafikusan határozzuk meg. E görbéből kiszámítható a 3 másodperces dózis („ED3”), vagy az a dózis (mg per kg-ban), amely 3 másodperccel meghosszabbítja a túlélési időt a 10 egérből álló kezeletlen kontroll csoporthoz viszonyítva. A túlélési idő 3 másodperces meghosszabbodása statisztikusan is szignifikáns és reprodukálható. A találmány szerinti vegyületek „ED3” értéke 0,5-10 mg/ kg intraperitoneális adás esetén. Megvizsgáljuk a vegyületek kiszorító hatását is, amit spiroperidolnak a patkány-agykéreg szerotoninerg receptoraihoz (5 -HT2) való kötődésére gyakorolnak. E próbához kivesszük a patkányok agyát, az agykérget elkülönítjük és 0 °C-on 50 térfogat pufferkeverékben homogenizáljuk; a puffer literenként 50 millimól Trisz-HCl puffert (pH 7,4), 120 millimól NaCl-ot és 5 millimól KCi-ot tartalmaz. A homogén keveréket 40000 x g gyorsulással 10 percig centrifugáljuk. Az üledéket ismét 50 térfogat pufferrel hígítjuk és a keveréket centrifugáljuk. Az üledéket mosás céljából a fenti púderben szuszpendáljuk. Ismét homogenizáljuk és centrifugáljuk, Végül a végső üledékei a fenti pufferrel hígítjuk 10 mg nedves szövet/1 ml pufTer arányban. Ekkor a szövetet 5 percig 37 °C-on 0,1 % aszkorhinsav és 10 mikromól/litcr pargilin jelenlétében elöinkubáljuk, majd 20 percig 0,3 nanomól/lilcr 3H- spiroperidollai (fajlagos aktivitás: 9,47 • 1011 Bq per millimól) és 0,0001-100 mikromól/liter vizsgálandó vegyülettel inkubáljuk. A keverékből I ml-cs részleteket veszünk ki, vákuumban átszűrjük, a szűrőket 2 x 5 ml hideg pufferrel mossuk és megszárítjuk. A radioaktivitást 5 g/liter 2,5-difenil-oxazolt (PPO) és 0,1 g/liter 1,4 - bisz(5 - fenil - oxazol - 2 - il) - benzolt (POPOP) tartalmazó toluolos elegyben mérjük. A vegyületek hatásosságának értékelése céljából a 3H-spiroperidol specifikus kötődésének %-os gátlását a kiszorító hatóanyag koncentrációjának függvényében ábrázoljuk. Grafikusan meghatározzuk az 1C50 koncentrációt, azaz a vizsgált vegyület azon koncentrációját, amely 50 %-kal gátolja a specifikus kötődést. A specifikus kötődést a 100 mikromól/liter 5 HT által kiszorított kötődés formájában határozzuk meg. ■ A találmány szerinti vegyületek IC50 koncentrációi többnyire 0,01 -I mikromól/litcr közé esnek. Végül megvizsgáljuk a találmány szerinti vegyületek kiszorító hatását a prazoszinnak (antihipertenzív szer) a patkány-agykéreg alfa,-receptoraihoz való kötődésére. Patkány-agykérget 30 térfogat Trisz-HCl pulferben (50 mikrontól per liter, pH 7,5) 30 másodpercig homogenizálunk, majd a homogenizátumot 45000 x gvel 10 percig centrifugáljuk. Az üledéket a pufferben újraszuszpendáljuk, homogenizáljuk és azonos körülmények között másodszor is centrifugáljuk. Végül a membránokat 100 térfogat fenti pufferben úgy szuszpendáljuk, hogy a végkoncentráció 10 mg nedves szövet per ml (vagy 0,55 mg fehérje per ml) legyen. Ezután 30 percig 25 °C-on 1 ml szuszpenziót 0,5 nanomól/liter 3H-prazoszin (specifikus aktivitás: 9,4 • 10" Bq per millimól) és 0,0001-100 mikrontól/ liter vizsgálandó vegyüld jelenlétében inkubáljuk. Inkubálás után mindegyik keverékből 0,45 ntl-l 3 ml púderrel hígítunk, gyorsan leszűrjük és a maradékot 2 x 5 ml hideg pufferrel mossuk. A szűrőket megszárítjuk és a radioaktivitást folyadékszcintillációs spektrométerben lemérjük. Minden vegyidéire megrajzoljuk a Tl-prazoszin kötődésének %-os gátlását a kiszorító hatóanyag koncentrációjának függvényében, és grafikusan meghatározzuk az ICS0 értéket, a specifikus kötődést 50 %-kal gátló koncentrációt. A specifikus kötődést a 10 mikromól/liter fentolamin jelenlétében kiszorított kötődésként definiáljuk. A találmány szerinti vegyületek IC50 koncentrációi 0,01-10 mikromól/liter közé esnek. A találmány szerinti vegyületek farmakológiai vizsgálata azt mutatja, hogy hipoxia-ellenes hatással rendelkeznek és a gyógyászatban kóros éberség kezelésére, különösen az agyi erek károsodásának és a geriátriában az agyi érelmeszesedésnek tulajdonítható magatartásbeli zavarok, valamint koponyasérülések okozta emlékezetkihagyások, mctabolikus agybetegségek és migrén, a szív- és perifériás erek betegségeinek és depressziós állapotok kezelésére használhatók. A találmány körébe ezért beletartoznak mindazok a gyógyszerkészítmények, amelyek hatóanyagként a találmány szerinti vegyületeket és/vagy sóikat tartalmazzák, az alkalmazásukhoz, különösen orális vagy parenterális alkalmazáshoz megfelelő segédanyagokkal együtt. A vegyületek orális vagy parenterális úton alkalmazhatók. A napi dózis parenterális alkalmazáskor 1-100 mg és orális alkalmazáskor 5-500 mg lehet. Szabadalmi igénypontok I. Eljárás az (I) általános képletü vegyületek, sóik, diasztereomer keverékek és tiszta izomerek előállítására, ahol a képletben 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 8
