195536. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 2-keto-L-gulonsav előállítására
1 195 536 2 Amint a 7. táblázatból látható, amelyben összehasonlítást teszünk azon esetek között, amikor nitrátot adunk a táptalajhoz vagy a fermentléhez a fermentáció kezdetén valamint a 2,5-diketo-D-glükonsav betáplálás kezdetén, és D-glükózt - amely hidrogéndonorként szolgál — adunk 2,5-diketo-D-glükonsav adagolásával együtt, illetve nem adunk ilyen adalékokat, nyilvánvaló, hogy a 2-kclo- L-gulonsav felhalmozódás a fermcntlében 8,2 mg/ml-től 40 mg/ml-ig nő (körülbelül ötszörös növekedés) és a 2- keto-L-gulonsav kitermelése (mól%) 41 %-tól 93%-ig nő. Mértük a sejtkoncentrációt optikai sűrűség (O.D.) egységekben, amikor a D-glükóz. eltűnik a fermcntléből, és a 8. táblázatban összegezzük az eredményeket. Ezek azt jelzik, hogy a nitrát nitrogénforrásként nem hatásos. Amint a 8. táblázatból látszik, bár a sejtkoncentrációban a nitrát hozzáadására fellépő növekedés csak 11,6%-ra korlátozódik, de az ammóniumsó hozzáadására körülbelül 40%-ra nő. Ez a tény azt mutatja, hogy a nitrát hatása nitrogénforrásként gyengébb, mint az ammóniumsóé. A fenti tényből megerősítést nyer az, hogy a nitrátnak a táptalajhoz való hozzáadása csak kis hatással van a sejtkoncentráció növekedésére, de nagyon előnyös hatása van a 2-keto-L-gulonsav termelés növekedésére, és a 2,5-diketo-D-glükonsav - 2-keto-L-gulonsawá való átalakítása moláris kitermelésének emelésére. 8. táblázat A tenyésztés kezdetén hozzáadott adalékok hatása a mikroorganizmusok növekedésére [A táblázatban felsorolt értékek 660 nm-nél mért optikai sűrűségben (O.D.) adják meg a sejtkoncentrációt a D- glükóz elfogyásának idején.] A tenyésztés kezdetén hozzáadott adalék Semmi 13,7 Nátrium-nitrát 15,3 Kálium-nitrát 15,0 Nátrium-nitrit 11,1 Ammónium-kiorid 19,3 5. példa [2,5-Diketo-D-glükonsav fermentlé sterilizálása felületaktív anyagokkal.] Az A előállítási példa szerint előállított fermentlevet néhány adagra szétosztjuk közvetlenül azután, hogy a tenyésztést megszakítottuk. A felsorolt felületaktív anyagokat aszeptikusán adjuk a fermentlé egyes adagjaihoz 0,025 súly/térf.% végső koncentrációig. Az alkalmazott felületaktív anyagokat a 9. táblázatban soroljuk fel. A felületaktív anyaggal való kezelést óvatos rázás közben 28 °C-on 6 óráig végezzük. Ezek közül a 2,5- diketo-D-glükonsav fermentlevek közül a nátrium-dodecil-szulfonáttal kezeltet használjuk a 2-keto-L-gulonsav (II) mutánssal való fermentálására, amelyet később írunk le. 9. táblázat Különböző felületaktív anyagok bactericid hatása a (III) FERM-P 5452 törzsre Felületaktív anyag (0,025 súly/térf.%) Csökkenés a milliliterenként! élő sejtszámban-- 28 °C-on Kezdeti 6 óráig tartó ' kezelés után Semmi 2.3 X109 1,5 X108 Nátrium-dodecil-szulfonát Zsírsav-szorbitát (Span 60, beszerezhető a Kaoo Atlas 2,3X10’ 7,5 X103 K.K.-tól) 2,3X10’ 2,2X10S Nátrium-sztearát 2,3X10’ 1,7X10® Nátrium-mirisztát 2,3X10’ 1,6X10® Nonion HS 210 2,3X10’ 3.8X104 HS 215 2,3X10’ 4,5 X104 (beszerezhető HS 230 2,3X10’ 6,7X104 a Nihon Yushi K. L 4 2,3X10’ 2,1X105 K.-tól) L NS 240 2,3X10’ 5.0X105 (1) D-glükóz hozzáadása a 2,5-diketo-D-glükonsav fermentléhez. 50%-os vizes D-glükóz oldatot adunk minden egyes nátrium-dodecil-szulfonáttal kezelt fermentléhez, a fermentlevet szűréssel sterilizáljuk, és a kezeletlen fertmentlé végső koncentrációját 3,8%-ra állítjuk be, közvetlenül a fermentlének a (II) mutáns tenyészetéhez való hozzáadása előtt. Ezek a 2,5-diketo-D-glükonsav fermentlevek szerepelnek a következőkben „szubsztrát oldat”-ként, és szolgálnak nyersanyagként a 2-keto-L-gulonsav termeléshez. (2) 2-Keto-L-gulonsav termelése 2,5-diketo-D-glükonsavból a (II) mutánssal. (i) Oltó tenyészet: A 2. példában leírt (1) oltó táptalajt egy kacsnyi 5- keto-D-glükonsav metabolizálásában defektiv és lényegében 2-keto-D-glükonsav termelésére képtelen FERM-BP 108 (II) mutánssal oltunk be. amelyet Corynebacterium sp. FERM-P 2770, ATCC No. 31 090-ből deriváltunk, és 28 °C-on 20—24 óra hosszáig inkubáljuk rázás közben (71 mm amplitúdó, 270 ford./perc). (ii) Fermentáció (a): A 4. példa (2) pontjában leírt fermentációs táptalajt, amely még 0,2% nátrium-nitrátot is tartalmaz, 50 ml oltó tenyészet oldattal oltjuk be, és 28 °C-on Í0— 16 óra hosszáig inkubáljuk 600 normál/ml/perc levegőztetés és 1740 ford./perc keverés mellett. (iii) Fermentáció (b): Miután a D-glükóz felhasználódott, és eltűnt a FERM-BP 108 (II) mutáns tenyészetéből, az(l) pontban leírtak szerint készített szubsztrát oldatot hozzáadjuk a tenyészethez úgy, hogy a 2,5-diketo-D-glükonsav koncentráció 0,2% legyen. Ezt követően a szubsztrát oldatot 15—120 percenként adagoljuk a tenyészethez, miközben nyomon követjük a 2,5-diketo-D-glükonsav fogyását a tenyészetben, és 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 10
