195536. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 2-keto-L-gulonsav előállítására
I 195 536 2 ügyelünk arra, hogy koncentrációja minden egyes betáplálás után közvetlenül körülbelül 0,2 % legyen. A szubsztrát oldat betáplálását a 45. óra után abbahagyjuk, de a tenyésztést további 3 óráig folytatjuk, így az összes tenyésztési idő a betáplálás kezdetétől számítva 5 48 óra lesz. A fermentléből előre meghatározott időközönként aszeptikusán mintát veszünk, meganalizáljuk 2,5-diketo- D-glükonsavra és 2-keto-L-gulonsavra, és megszámoljuk a mintában lévő élő sejteket [lásd (3) pont], 10 Az analízis és a scjtszámlálás eredményeit a 10. táblázatban összegezzük. (3) A (III) törzs élő sejtjei számának meghatározása. A fermentlé mintáját sterilizált fiziológiás sóoldattal hígítjuk, és glicerines húsleves agar táptalajon szélesztjük, ^ amelyet utána 28 °C-on, 24—36 óra hosszáig inkubálunk. A táptalajon lévő élő sejtek számát a telepek számával határozzuk meg. Megjegyzés: mivel a (III) törzs növekedési sebessége jóval nagyobb mint a (II) mutánsé, a (II) mutáns setjeivel összekeveredett (III) törzs sejtjei különösebb nehézség nélkül külön megszámolhatok. A fenti kísérletek eredményeiből a következő tényeket tudjuk alátámasztani: (1) A 2,5-diketo-D-glükonsav fcrmcntlcbcn lévő (III) ® törzs részére baktericid szerként ajánlott és kipróbált különböző felületaktív anyagok közül a nátrium-dodecilszulfonát a legkiválóbb a baktericid hatás szempontjából ( lásd 9. táblázat). 30 (2) Azon 2-keto-L-guIonsav termelési kísérletek eredményeképp (lásd 10. táblázat), amelyekben az előbbi körülmények között háromféle különbözőképp készített szubsztrát-oldatot alkalmaztunk; (i) abban a fermentációs kísérletben, amelyben a keze- 35 letlen szubsztrát oldatot használtuk, a (III) törzs élő sejtjeinek száma a szubsztrát oldat beadagolásának kezdete után 24 órával 10s —107 scjt/ml-re nőtt, míg a 2-keto-L-gulonsav felhalmozódás a másik két kísérlethez viszonyítva 24 óra múlva úgyszólván alig nőtt; (ii) abban a fermentációs kísérletben, ahol a nátriumdodecil-szulfonáttal.'kezelt szubsztrát oldatot adagoltuk, a (III) törzs élő sejtjei számának növekedése hatásosan 104 sejt/ml-nél kevesebbre korlátozódott még a szubsztrát oldat hozzáadásának kezdetétől számított 48 óra múlva is, és a 2-keto-L-gulonsav felhalmozódása körülbelül 27 mg/ml-re nőtt; (iii) az (ii) pontnál említett 2-keto-L-gulonsav felhalmozódás egyforma azzal a fermentációs kísérletével, amelyben a szűréssel sterilizált szubsztrát oldatot használtuk; és (iv) Az utóbb említett fermentációs kísérletben, amelyben szűréssel sterilizált szubsztrát oldatot adagoltunk, a (III) törzs élő sejtjeit nem tudtuk kimutatni, és a 2-keto-L-gulonsav termelés minden nehézség nélkül végbement. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás 2-keto-L-gulonsav előállítására 2,5-diketo- D-glükonsav átalakításával 2-kcto-L-gulonsav termelésére képes élő, vagy feldolgozott mikroorganizmus jelenlétében vizes táptalajban, amelyhez 2,5-diketo-D-glükonsavat adunk, vagy kalcium-2,5-diketo-D-glükonát vizes oldata alakjában, vagy a Gluconobacter vagy Erwinia nemzetséghez tartozó, 2,5-diketo-D-glükonsavat termelő mikroorganizmus D-glükózt tartalmazó táptalajban való tenyésztésével kapott, adott esetben sterilizált fermentlé alakjában, a 2-keto-L-gulonsav feldúsításával, és a feldúsított 2-keto-L-gulonsavnak a fermentlével való elkülönítésével, azzal jellemezve, hogy a Corynebacterium nemzetséghez tartozó és 2,5-diketo-D-glükonsav 2-keto- L-gulonsavvá való átalakítására képes mikroorganizmusokat mutagén kezelésnek vetünk alá, a kezelt sejteket D-glükonsavat, mint egyedüli szénforrást tartalmazó 10. táblázat A 25 DKG* fermentlé betáplálásának kezdete utáni idő (óra) 25 DKG fermentlé baktericides kezelése Kezeletlen Kezelés nátrium-dodecilszulfonáttal Sterilezés szűréssel Termelt 2 KLG* ** (mg/ml) 10,2 10,8 10,9 8 A (Hl) törzs élő sejtjeinek száma (sejt/ml) 8.9X103 nem volt mérve nem volt mérve Termelt 2 KLG (mg/ml) 14,8 18,6 18,7 24 A (III) törzs élő sejtjeinek száma (sejt/ml) 2,3 X105 3,5X 103 nem volt mérve Termelt 2 KLG (mg/ml) 15,8 26,6 26,3 48 A (III) törzs élő sejtjeinek száma (sejt/ml) 3.1X107 3.3X104 nem volt mérve *25 DKG: 2,5-diketo-D-glükonsav, **2KLC: 2-kcto-L-gulonsav. 11
