195536. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 2-keto-L-gulonsav előállítására

1

195 536

2

eltávolítása céljából, és a felülúszót szűréssel sterilizáljuk (2,5-diketo-D-glükonsav koncentráció: 19%).

A sterilizált fermcntlcvct sterilizált 50%-os vizes D-glükóz oldattal elegyítjük, amíg a hidrogéndonor D-glükóz koncentrációja 3,8% lesz a fermentleben.

(2) Fermentációs táptalaj (a 2-keto-L-gulonsav előállítására megfelelő példákhoz szokásos):

2,0% D-Glükózt,

3,0% kukoricalekvárt,

0,1 % kálium-dihidrogén-foszfátot,

0,02% magnézium-szulfát heptahidrűtot és 0,01 % polipropilén-glikol (P-2000) habzásgátlót tartalmazó vizes oldat pH-ját 7,0-7,2-re állítjuk és 450 ml-es adagokat 115 °C-on 20 percig sterilizálunk, és aszeptikusán 1 literes sterilizált fermentorba töltjük.

(3) Nitrogénvegyület adalékok készítése. Nátrium-nitrátból, kálium-nitrátból, nátrium-nitritből és ammónium-kloridból külön-külön 10%-os vizes oldatot készítünk, és szűréssel sterilizáljuk, hogy a tenyésztés kezdetén és a 2,5-diketo-D-glükonsav betáplálás kezdetén adjuk hozzá az adalékokat a táptalajhoz.

(4) Fermentáció (2-keto-L-gulonsav előállítására).

A 2. példában leírt (1) oltótáptalajt egy kacsnyi 5- keto-D-glükonsav metabolizálásában defektiv, és lényegében 2-keto-D-glükonsav. termelésére képtelen FERM-BP 108 mutánssal oltjuk be, amelyet Corynebacterium sp. FERM-P 2770, ATCC No. 31 090-ből deriváltunk, és a beoltott táptalajt rázás közben 28 °C-on 20-24 óra hosszáig inkubáljuk. Az oltótenyészet 50-50 miét

oltjuk a (2) fermentációs táptalajba, és a (3) pont szerint készített különböző nitrogénvegyület adalékok 0,25 %-os végső koncentráció eléréséig való aszeptikus hozzáadása után 28 °C-on 1,2 térf./térf./perc levegőztetés és 1740 5 ford./perc keverés mellett 10-16 óra hosszáig tenyésztjük.

Miután az előbb leírt kvantitatív meghatározással meggyőződünk a D-glükóz elfogyásáról, újból hozzáadunk a (3) pont szerinti nitrogénvegyület adalékokból 10 0,1% végső koncentrációig. Továbbá 3,8% D-glükózt tartalmazó 2,5-dikcto-D-glükonsav fermentlevet adunk hozzá 0,2% végső D-glükóz koncentrációig.

Ezt követően 2,5-diketo-D-glükonsavat adagolunk apránként a tenyészethez 15—120 percenként körill^ belül 0.2% koncentrációig, közben minden egyes betáplálás után nyomon követjük az illető sav elfogyását a fermentlcből. ■

A 2,5-diketo-D-glükonsav betáplálást a beadagolás 20 kezdete után 45 órával megszüntetjük, de a tenyésztést további 3 óráig folytatjuk (összes tenyésztési idő az indulástól: 48 óra).

Miután a tenyésztést befejeztük, a fermentlét gázkromatográfiával meganalizáljuk 2-keto-L-gulonsavra, 25 2-keto-D-glükonsavra és 2,5-diketo-D-glükonsavra.

Eredményként megállapíthatjuk, hogy a ferméntlevek egyikéből sem mutatható ki 2-keto-D-glükonsav. A különböző nitrogénvegyület adalékokkal dúsított fermcntlcvckbcn felhalmozódott 2-kcto-L-gulonsav mennyi- 30 segeket a 7. táblázatban összegezzük.

7. táblázat

Az eredeti fermentációs táptalajhoz és a táptalajhoz a 2,5-diketo-D-glükonsav betáplálás kezdetén adott különböző nitrogénvegyület adalékok előnyös hatása a 2-keto-L-gulonsav felhalmozódására

A táblázatban megadott értékek a fcrmentlébcn felhalmozódott 2-kcto-L-gulonsav töménységét, a zárójelben lévő értékek a prekurzorból keletkezett 2-keto-L-gulonsav moláris kitermelését adják meg, amelyet a [termelt 2-keto-L-gulonsav (mól): betáplált 2,5-diketo-D-glükonsav (mól)]X 100 képlettel számítottunk.

\. A 2,5-Diketo-D-glükonsav N. betáplálás kezdetén hozzá- N. adott nitrogénvegyület

D-Glükóz hidrogéndonor \ jelenléte \

2-Keto-L-gulonsav felhalmozódás, mg/ml; (2-kcto-L-gulonsav moláris kitermelése, %)

Semmi

Nátriumnitrát

Káliumnitrát

Nátriumnitrit

Ammóniumklorid

Az eredeti fermen- \ \ tációs táptalajhoz \ adott nitrogén- / \ vegyület / \

mg/ml

%

mg/ml

%

mg/ml

%

mg/ml

%

mg/mi

%

Semmi nem

8,2

(41)

8,9

(43)

9,0

(43)

3,9

(38)

8,9

(46)

igen

15,7

(75)

22,0

(87)

22,1

(86)

6,0

(62)

16,0

(78)

Nátrium-nitrát nem

8,6

(49)

12.1

(48)

4,4

(45)

9,2

(43)

igen

26,5

(91)

40,2

(93)

16,0

(88)

27,5

(90)

Kálium-nitrát nem

8,8

(52)

12,2

(46)

igen

25,8

(92)

40,3

(93)

Nátrium-nitrit nem

3,2

(31)

3,6

(38)

igen

8,1

(54)

7,8

(53)

Ammónium-klorid nem

9,2

(42)

9,7

(45)

igen

17,0

(78)

18,3

(80)

9