195536. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 2-keto-L-gulonsav előállítására
1 195 536 2 0,1 % kálium-dihidrogén-foszfátot és 0,02% magnézium-szulfát heptahidrátot tartalmazó vizes oldat pN-jdt 10%-os nátrium-hidroxid oldattal 7-7,2-rc állítjuk. 50-50 ml-cs adagokat töltünk 500 ml-es kúpos lombikokba, és 115 °C-on 20 percig sterilizáljuk. (3) 2—Keto-L-gulonsav előállítása. Az (1) oltó táptalajt beoltjuk egy-egy kacsnyi 2-keto- L-gulonsav termelő mikroorganizmussal [(I) szülő] vagy az (I)-ből derivált (II) mutánssal, amelyek a 4. táblázatban láthatók, és a beoltott táptalajt 28 °C-on 24 óra hosszáig tenyésztjük. Utána 5-5 ml oltótenyészetet oltunk a (2) fermentációs táptalajba, és tenyésztjük. A 2,5-diketo-D-glükonsav oldatok valamelyikét (A és B előállítási példák) adjuk a fermentléhez 2% végső koncentráció eléréséig a kezdéskor és a fermentáció kezdőiétől számított 16 órán belül bármely időben, és a fermentációt további 48 óra hosszáig folytatjuk. A termékek gáz-folyadék kromatográfiájának eredményeit a 4. táblázatban összegezzük. Amint a 4. táblázatban jelezzük, a (II) mutáns fermentleveiből nem mutattunk ki 2-keto-D-glükonsavat, míg az (I) szülő törzs fermcntlevébcn jelentős mennyiségű 2-kcto-D-g!ükonsav voll. 3. példa [Sejtszuszpenzió és sejtkivonat használata 2-keto-L-gulonsav kontakt-termelésben.] (1) Oltó tenyészet: A 2. példában leírt (1) oltó táptalajt beoltjuk egy kacsnyi Corynebacterium sp. FERM-P 2770-nel (I), vagy az 5-keto-D-gíükonsav metabolizálásában defektiv, és 2-keto-D-glükonsav termelésre lényegében képtelen FERM-BP 108 mutánssal (II), és rázás közben 28 °C-on 24 óra hosszáig tenyésztjük. (2) Tenyészet sejtszuszpenzió vagy sejtkivonat előállításához: 455 ml 2. példa (2) pontjában leírt fermentációs táptalajt, amely még 0,01% habzásgátló polipropilénglikol P 2000-t tartalmaz, aszeptikusán egy I literes fermentorba töltünk, és 45 ml (I) oltókultiirűval beoltjuk. A fermentációt 28 °C-on 16 óra hosszáig végezzük 1740 ford./perc keverés, és 600 normál ml/perc levegőztetéssel. (3) Sejtszuszpenzió készítése: A (2) tenyészetet 15 000 ford./perc-nél centrifugáljuk a sejtek összegyűjtése céljából, amelyeket utána kétszer mosunk fiziológiás sóoldattal. A mosott sejteket 0,05 mólos trisz-pufferban (pH = 7,5) szuszpendáljuk OD660 nm = 12 szuszpenzióig. (4) Sejtkivonat készítése: A mosott sejteket a (3) pontban leírthoz hasonló módszerrel szuszpendáljuk 0,05 mólos trisz-pufferban (pH = 7,8) Oüf,ön = 100 szuszpenzióig, amelyet egy sejtprésen nyomatunk át 131 kPo nyomáson. Az érintetlen sejteket és a sejt törnie lé két 20 000 G-nél 30 percig tartó centrifugálással eltávolítjuk. A visszamaradó felülúszót 0,05 mólos trisz-pufferrel (pH = 7,5) szemben 15 óra hosszáig dializáljuk, és a kapott folyadékot tekintjük sejtkivonatnak. (5) 2-Keto-L-gulonsav termelése a (3) scjtszuszpcnzióval. 8 ml (3) sejtszuszpenziót elegyítünk 2 ml 2,5-diketo-D-glükonsav-kalciumsó oldattal {B előállítási példa), és az elegyet rázás közben 30 °C-on 15 óra hosszáig hagyjuk reagálni. Ezután a reakcióelegyet 15 000 G-nél 15 percig centrifugáljuk a sejtek eltávolítása céljából, és gáz-folyadék kromatográfiával meganalizáljuk 2-keto-L- gulonsavra és 2-keto-D-glükonsavra. A kvantitatív meghatározás eredményeit az 5. táblázatban adjuk meg. 5. táblázat A sejtszuszpenzió készítésére Koncentráció használt mikroorganizmusok: a reakcióelegyben: Corynebacterium sp 2-keto-L- 2-keto-DFERM-P 2770 gulonsav glükonsav ATCC 31 090 1,93 ing/ml 0,64 mg/ml 5-Keto-D-glükonsav metabolizálásában defektiv FERM-BP 108 mutáns 2,65 mg/ml 0 mg/ml (6) 2-Keto-L-gulonsav termelése a (4) sejtkivonattal: 0,5 ml (4) sejtkivouatot adunk 2,5 ml 0,1 mólos trisz-pufferhoz (pH = 7,5), amely 75 jrmól 2,5.-diketo- D-glükonsav-kalciumsót és 15 pmól NADPH-t (redukált nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfátot) tartalmaz, és 30 °C-on 16 óra hosszáig hagyjuk reagálni. A reakcióclcgy kvantitatív meghatározásának eredményeit a 6. táblázatban adjuk meg. 6. táblázat A sejtkivonat készítésére Koncentráció használt mikroorganizmusok: reakcióelegyben: 2-keto-L-2-keto-DCorynebacterium sp. gulonsav glükonsav FERM-P 2770 5-Keto-D-glükonsav metabolizálásában defektiv 285 /Jg/ml 32 Atg/ml FERM-BP 108 mutáns 356 /rg/ml OjUg/ml A fenti 5. és 6. táblázatokban látható eredményekből kiderült, hogy 2-keto-L-gulonsav keletkezett mindegyik reakcióban, ahol a (3) sejtszuszpenziót vagy a (4) sejtkivonatot használtuk. Mindkét esetben a terméket a jelenlévő 2-keto-L- gulonsavat termelő mikroorganizmus törzs termelte, azonban az (I) FERM-P 2770 törzs 2-keto-D-glükonsavat is termel a 2-keto-L-gulonsavval együtt, míg a (II) mutáns termel 2-keto-L-gulonsavat, de nem termel 2-kcto-Dglükonsavat. 4. példa (Nitrát és hidrogéndonor hozzáadása a fermentléhez.] (1) 2.5-Diketo-D-glükonsav fermentlé. Az A előállítási példa szerint készített fermentlét 10 000 ford./perc-nél 15 percig centrifugáljuk a sejtek 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 8
