195536. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 2-keto-L-gulonsav előállítására
1 195 536 2 1. példa [A (II) mutáns deriválása.] (1) Folyékony táptalaj: 1 % Bacto marhahús kivonatot (Difco), 1 % Bacto peptont és 0,5 % nátrium-kloridot tartalmazó vizes oldat pll-ját 7,2-rc állítjuk. A oldat 50 ml-es részleteit 500 ml-es kúpos lombikokba töltjük, és 115 °C-on 20 percig sterilizáljuk. (2) Minimál (agar) táptalaj. és 115 C-oii 15 percig sterilizáljuk. Ammónium-klorid 0,5% ammónium-nitrát 0,1% nátrium-szulfát 0,2% magnézium-szulfát-heptahidrát 0,1 % kalcium-karbonát 0.0001 % kálium-dihidrogén-foszfát 0,3 % dikálium-hidrogcn-foszfát 0,1 % nyomelem oldat* 0,1% vitamin oldat** 0,1% és agar 2,0%. *Nyomelem oldat (alkotórészek 1 liter oldathoz): Dinálrium-tetraborát-dekaliidrát 88 mg, ammónium-molibdenát-tetraliidrát 37 mg, vas(lII)-triklorid-liexahidrát 970 mg, cink-szulfát-heptalüdrát 88 mg, réz(II)-szulfát-pentahidrát 270 mg és mangán(lí)-diklorid-tetrahidrát 27 mg. **VHantin oldat (alkotórészek I liter oldathoz): Tiamin l,0mg, pantoténsav 10 mg, niacin 10 mg és biotin 0,1 mg. (3) D-Glükonsav és 5-keto-D-glükonsav oldata. Nátrium-D-glükonát és nátrium-5-keto-D-glükonát 10%-os vizes oldatainak pH-ját 6,8-7,2-re állítjuk, és szűréssel sterilizáljuk. (4) A mutánsok elkülönítésének módja. Egy-egy kacsnyi Corynebacterium sp. FERM-P 2770-t és Corynebacterium sp. FERM-P 2687-t oltunk az (1) folyékony táptalajra, és 28 °C-on 8 óra hosszáig tenyésztjük. Minden egyes tenyészethez előzetesen sterilizált 0,2%-os vizes N-metil-N'-nitro-N-nitrozo-guanidin oldatot adunk 0,02% végső koncentrációig, és utána a tenyésztést még 30 percig folytatjuk. A tenyészetet centrifugáljuk [10 000 ford./perc, 15 perc], és a sejteket összegyűjtjük. Az összegyűjtött sejteket háromszor mossuk sterilizált fiziológiás nátrium-klorid oldattal, és 10-10 ml nátrium-kiorid oldatban szuszpendáljuk. A szuszpenziókból 1-1 ml-t oltunk az (1) táptalajra, és 28 °C-on 15 óra hosszáig tenyésztjük. A tenyészetet utána 102—103 élő sejt/ml-re hígítjuk sterilizált nátrium-klorid oldattal. Utána minden egyes hígított tenyészetből 0,5—1 ml-t szélesztünk a (3) D-glükonsav oldat és a (2) minimál agar táptalaj 1 :9 arányú keverésével készített lemezeken, és 28 °C-on 3-5 napig hagyjuk tenyészni. A kinőtt sejtek telepeit [a 3. táblázat (1) törzse! amely D'-glükonsav táptalajon tenyészik] bársony kendővel átvisszük a (3) 5-keto-D-glükonsav oldat és a (2) minimál agar táptalaj 1 :9 arányú keverésével készített táptalaj lemezre. 3—5 nap tenyésztés után azoknak a sejteknek a telepeit, amelyek a D-glükonsav táptalajon nőnek, de iiz 5-kclo-l)-glükonsnv táptalajon nem nőnek, leszedjük, és D-glükonsav táptalajra oltjuk tenyészteni. Az így szelektált mutánst [a 3. táblázatban (2) törzs, amely nem nő az 5-keto-D-glükonsav táptalajon] 1 % 5-keto-D-glükonsavat tartalmazó (1) táptalajra oltjuk, és 28 °C-on 24 óra hosszáig tenyésztjük. A tenyészetben megmaradó 5-kcto-D-gliikonsavat papírkromatográfiával meghatározzuk, hogy megerősítsük, hogy ez a (2) törzs nem képes 5-keto-D-g!ükonsavat hasznosítani. A 2. példában leírt (2) táptalajt beoltjuk egy kacsnyi mutánssal, amelyről bebizonyosodott, hogy nem képes 5-keto-D-glükonsavat hasznosítani [(3) törzs a 3. táblázatban], és 20 órán keresztül inkubáljuk. Az így inkubált táptalajhoz adjuk 1.0% végső koncentrációig a kalcium-2,5-diketo-D-glükonát oldatot, amelyet a B előállítási példában írunk le, és az inkubálást további 24 órán keresztül folytatjuk. A tenyészclegyben lévő 2-keto-D-glükonsav és 2-keto- L-gulonsav mennyiségét papírkromatográfia segítségével határozzuk meg. Az eredmények à 3. táblázatban láthatók. így 84 520 mutagenizált Corynebacterium sp. FERM-P 2770 telepből 308 kívánt mutánst kapunk, amelyek defektívek 5-keto-D-glükonsav metabolizálásában, és lényegében képtelenek 2-keto-D-glükonsav termelésére. és hasonló módon 11 kívánt mutánst kapunk 29,100 mutagenizált Corynebacterium sp. FERM-P 2687 telepből. 3. táblázat 2-Keto-L-gulonsavat termelő mikroorganizmus (szülők) Coryne- Corynebacterium bacterium sp. FERM-P sp. FERM-P 2770 2687 (A mutáns törzsek száma) Törzsek (1), amelyek D-glükonsav táptalajon 84,520 29,100 tenyésznek Olyan (1) törzsek (2), 45 amelyek 5-keto-D-glükonsavtáptalajon nem tenyésznek Olyan (1) törzsek (3), 363 amelyek 5-keto-D-glükonsavat nem hasznosítanak 319 13 Olyan (3) törzsek, amelyek 2-keto-L-gulonsavat termelnek, ^Qg de nem termelnek 2-keto-D- glükonsavat. 11 A előállítási példa. (2,5-Diketo-D-glükonsav fermentlé) (i) Oltó táptalaj : 1,0% D-G!ükózt, 5,0% kukoricalekvárt, 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
