195536. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 2-keto-L-gulonsav előállítására
1 195 536 2 zák a fenti eljárásban, akkor a 2-keto-L-gulonsav termelése jelentősen gátolt. Kiterjedt vizsgálat eredményeképpen világossá vált, hogy a gátlási jelenség abban az esetben fordul elő, ha a (III) törzs 105 élő sejt/ml feletti mennyiségben tenyészik az eljárás során. A (III) törzs sterilizálási módszerként a 2,5-diketo- D-glükonsav fermentlében a hősterilizálást és a szűréssel való sterilizálást vizsgálták meg. A 2,5-diketo-D-glükonsav hőérzékenysége és a szűréssel való sterilizálás ipari méretben nagy költségekkel is csak gyenge eredményességgel megvalósítható volta miatt a feltalálók a (III) törzs sterilizálásának egy másfajta megvalósítási módszerét találták alkalmazhátónak 2-keto-L-gulonsav ipari termelésének megvalósítása céljára. Egy sor különféle vizsgálat után a feltalálók a harmadik megoldást, a (III) törzs valamilyen felületaktív anyaggal való sterilizálásának módszerét találták biztonságosan és olcsón megvalósíthatónak. A jelen találmány szempontjából ennek az az előnye van, hogy nincs szükség további, különlegesen a sterilizálásra tervezett berendezésre az eljárás megvalósításához, a felületaktív anyag könnyen kiválasztható a sok ilyen közül, hogy ne gátolja a (II) mutáns 2-keto-L-gulonsav termelését, és a felületaktív anyag maga olcsó és könnyen hozzáférhető. További haladás az, hogy az eljárás könnyen megvalósítható nagy méretekben való termelésnél. A vizsgált felületaktív anyagok közül a nátrium-dodecil-szulfonátot találtuk különösen előnyösnek. A találmány szerinti eljárás röviden a következőképp szemléltethető. Először, a D-glükóz szubsztrátot, nitrogénforrásként kukoricalekvárt és szervetlen sókat tartalmazó táptalajt beoltjuk a 2,5-diketo-D-glükonsavat termelő (III) törzszsel, és 28 °C-on tenyésztjük keverés és levegőztetés közben. Ezt követően a fent leírt módon készített fermentlevet két részre osztjuk, és az egyiket 0,01-0,25 súly/térf.% végső koncentrációig aszeptikusán adagolt felületaktív anyaggal kezeljük, és 5-28 °C-on hagyjuk néhány órát állni óvatos, és mérsékelt keverés közben. A másik részt felületaktív anyag hozzáadása nélkül hagyjuk állni hasonlóképpen 5—28 °C-on néhány óra hosszáig. A felületaktív anyaggal, például nátrium-dodecilszulfonáttal való kezelés alatt a (III) törzs élő sejtjeinek száma a kezelt fermentlében kevesebb, mint egymilliomod részére csökken a kezeletlenben lévő élő sejtszámhoz képest. A csökkenés azonban az alkalmazott törzstől és felületaktív anyagtól függően változik. A kezeletlen 2,5-diketo-D-glükonsav fcrmcntlé egy másik részét szűréssel sterilezzük. Ezután hidrogéndonorként glükózt adunk aszeptikus körülmények között a felületaktív anyaggal kezelt fermentléhez, a szűréssel sterilezett fermentléhez, illetve a kezeletlen 2,5-diketo D-glükonsav fermentléhez 1-10% végső koncentrációig, mielőtt a fermen Heveket hozzáadnánk a (II) mutáns tenyészetéhez. A fentiektől függetlenül a (II) mutánst megfelelően tenyésztjük a 2,5-diketo-D-glükonsav fertmentlé felületaktív anyaggal való kezelésének ideje alatt. A (II) mutáns tenyészetéhez 15-120 perces időközönként adagonként betápláljuk az előbb készített három 2,5- diketo-D-glükonsav fermentlét úgy. hogy 0,05—2,0%1 2,5-diketo-D-glükonsav koncentrációt érjünk el, közben figyeljük a fermentlében megmaradó 2,5-diketo-D- glükonsav mennyiségét, és a tenyésztést a betáplálás kezdete után 48 óráig folytatjuk. A felületaktív anyaggal való sterilezés, vagy a szűréssel való sterilez.és esetében is a 2,5-diketo-D-glükonsav simán átalakul 2-keto-L-gulonsavvá. Viszont a sterilizálás elhagyása esetében a (III) törzs sejtszaporulata több, mint 105 sejt/ml fölé emelkedik, és végül leállítja a 2-kcto-L-gulonsav termelését. Amint később a példában szemléltetjük, a sterilizálás felületaktív anyaggal való kezeléssel vagy szűréssel végezhető. Mivel azonban a fermentlé szűrésével való sterilizálása csak lépcsőzetes kezeléssel lehetséges, ha a fermentlé nagy koncentrációban tartalmaz 2,5-diketo-D-glükonsavat, erre való tekintettel ennek megvalósítása ipari termelési léptékben költségessége miatt csaknem lehetetlen. Ennélfogva a jelen találmány szerinti felületaktív anyaggal való sterilezés nagy jelentőségűnek bizonyult. Az előnyös megvalósítások leírása: A következő leírásban a jelen találmányt példa útján részletesebben szemléltetjük. A leírás tartalma és részletezése a következő: 1. példa A (II) mutáns deriválása. A előállítási példa: 2,5-Diketo-D-glükonsav fermentlé. B előállítási példa: 2,5-Diketo-l)-glükonsavkalciumsó oldata. 2. példa A (II) mutáns alkalmazása 2-keto-L-gulonsav fermentációval való előállításában. ■' 3. példa. A (II) mutáns sejtszuszpenziójának és sejtextraktumának felhasználása 2-keto-L-gutonsav termelésében. 4. példa. Nitrátsó és hidrogéndonor hozzáadása a fermentléhez. 5. példa. 2,5-Diketo-D-glükonsav fermentlé sterilizálása felületaktív anyaggal. Analízis módszer: (i) 2-Keto-L-gulonsav, 2-keto-D-gulonsav és 2,5-diketo-D-glükonsav. (a) Gáz-folyadék kromatográfia: Oszlop: SE 52 (5%); minta: trimetil-szililezve; vivőgáz: hélium; hőmérséklet: 160—210 C. (b) Papír-vagy vékonyréteg-kromatográfia: Hordozó: Toyo Roshi No. 50, vagy cellulóz vékonyréteg alumíniumfólián (beszerezhető a Toyo Roshi K. K. vagy Merck A. G. cégektől). Kifejlesztő oldószer: fenol : hangyasav :víz = 75 :4 :25. Színreagens: Anilin-hidrogén-ftalát (AHF) oldat. (Készítése: 0,93 g anilint és 1,66 g ftálsavat oldunk 100 ml vízzel telített n-butanolban). A kromatogramot bepermetezés után 105 °C-on 2 percig melegítjük. (ii) D-glükóz: „Glucose B test”. Beszerezhető a Wako Junyaku Kógyó K. K. cégtől. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
