195536. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 2-keto-L-gulonsav előállítására
1 195 536 2 A jelen találmány általánosságban 2-keto-L-gulonsav 2,5-diketo-D-g!ükonsav mikrobiális (fermentativ, vagy cnzimatikns) redukciójával való előállítására vonatkozik. Részletesebben a találmány kapcsolatos: egy újonnan indukált mutáns használatával, amely defektiv az 5-keto- D-glükonsav és a redukciós eljárásban keletkező bármely termékének metabolizálásnban; valamilyen nitrát sónak, és valamilyen hidrogéndonorhak a redukciós rendszerhez való hozzáadásával, és olyan fermentlé valamilyen felületaktív anyaggal való sterilizálásával, amelyben valamilyen 2,5-diketo-D-glükonsavat termelő mikroorganizmust tenyésztettünk, és amelyet a mutáns által redukálandó nyersanyagként használunk. A feltalálók már korábban találtak 2,5-diketo-D-glükonsavból 2-keto-L-gulonsav termelésére képes különböző mikroorganizmusokat [a továbbiakban 2-keto-L- gulonsavat termelő (I) törzs], és bejelentettek eljárásokat 2-keto-L-gulonsavnak a mikroorganizmusok segítségével való előállítására. [Lásd például a 3 922 194 (RE 30 872) sz„ 3 959 076 sz. és 3 963 574 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásokat.] Ezen (1) törzsek mindegyike nem kívánt melléktermékként 2-keto- D-glükonsavat termel 2.5-diketo-D-glükonsavból, valamint a fő termékként 2-keto-L-gulonsavat. A feltalálók bejelentettek egy kevert tenyészetes eljárást is ennek, a nem kívánt 2-keto-D-glükonsavnak a táptalajban való felhalmozódásának a megakadályozására. (Lásd például a 3 998 697 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírást.) Mindamellett 2-keto L-gulonsav előállítására egy iparilag megvalósíthatóbb eljárás kidolgozása régóta kívánatos volt. A 2-keto-L-gulonsav 2,5-diketo-D-giükonsavból való termelésében és moláris kitermelésében való javulás azonban még váratott a megvalósításra. Ennélfogva a jelen találmány feladata az volt, hogy biztosítson egy javított mikrobiális eljárást 2-keto-L- gulonsav 2,5-diketo-D-glükonsavból való előállítására, amelyben az újonnan indukált mutánst alkalmazzuk a nem kívánt 2-keto-D-glükonsavnak a fermentlében való felhalmozódásának minimalizálására. A jelen találmány célja továbbá, hogy javítsa az említett eljárást, amelyben valamilyen nitrát sót és hidrogéndonorként szénhidrátot vagy polihidroxi-alkoholt adunk a mutáns fermentációs táptalajához, és/vagy az eljárás kiindulási anyagaként a táptalajhoz adandó 2,5-diketo- D-glukonsavhoz. A jelen találmány célja továbbá az említett eljárás javítása, amennyiben 2,5-diketo-D-glükonsav fermentlevet használunk az eljárás kiindulási anyagaként, és a fermentlevet előzetesen valamilyen felületaktív szerrel sterilizáljuk a 2,5-diketo-D-glükonsavat termelő és túlélő sejtek számának indokolt mértékig való, csökkentése céljából. A jelen találmány eljárás 2-Íceto-L-gulonsav előállítására 2,5-dikcto-D-gliikonsav átalakításával 2-keto-L- gulonsav termelésére képes élő, vagy feldolgozott mikroorganizmus jelenlétében vizes táptalajban, amelyhez 2,5-diketo-D-glükonsavat adunk, vagy kalcium-2,5-diketo-D-glükonát vizes oldata alakjában vagy a Gluconobacter vagy Erwinia nemzetséghez tartozó, 2.5-dikcto- D-glükonsavat termelő mikroorganizmus D-glükózt tartalmazó táptalajban való tenyésztésével kapott, adott esetben sterilizált fermentlé alakjában, a 2-keto-L-gulonsav feldúsításával és a feldúsított 2-keto-L-gulonsavnak a fermentlétől való elkülönítésével oly módon, hogy Corynebactcrium nemzetséghez tartozó és 2,5-diketo- D-glükonsav 2-keto-L-gulonsavvá való átalakítására képes mikroorganizmusokat mu tagén kezelésnek vetünk alá, a kezelt sejteket D-glükonsavat, mint egyedüli szénforrást tartalmazó tápközegre oltjuk, majd a kifejlődött telepeket 5-kcto-Dglükonsavat, mint egyedüli szénforrást tartalmazó tápközegre oltjuk, a D-glükonsavon, mint egyedüli szénforráson növekvő, de 5-keto-D-glükonsavon, mint egyedüli szénforráson nem növekvő telepeket izoláljuk, és a telepek közül a 2,5-diketc-D- glükonsavbó! 2-keto-L-gulonsavat termelő, de 2-keto-D- glükonsavat lényegében nem termelő telepeket kiválasztjuk, és az átalakítást az így kiválasztott mutánsok alkalmazásával végezzük. A találmány leírása során és az igénypontokban az „élő vagy feldolgozott mikroorganizmus” kifejezés a mikroorganizmus sejtjeinek kezelésével kapott valamilyen feldolgozott terméket, valamint a növekvő, vagy nyugalomban lévő mikroorganizmust jelenti. A feldolgozott termék lehet például sejtszuszpenzió, sejtkivonat, nyers vagy tisztított enzim, vagy a mikroorganizmusokból kapott sejtzúzalák. Az eljárás során említett valamennyi sav esetén bármely sója is értendő. A jelen találmány szerint egy tovább javított eljárást biztosítunk, amelyben az említett mutáns tenyésztése és a 2,5-diketo-D-glükonsav 2-keto-L-gulonsavvá való álalakítása valamilyen hidrogéiulonor vagy valamilyen nitrát só jelenlétében történik. A hidrogéndonor adható a 2,5-diketo-D-glükonsavva! együtt a táptalajhoz, vagy külön is. A nitrát adható a táptalajhoz a tenyésztés kezdetén, és/vagy hozzáadható a táptalajhoz kezdetben, vagy bármely időben a 2,5-diketo-D-glükonsav adagolása alatt. Egy másik szempont szerint a jelen találmány még további javítást biztosít, amennyiben olyan fermentlevet adunk 2,5-diketo-D-glükonsav-forrásként a táptalajhoz, amelyben 2,5-diketo-D-glükonsavat termelő mikroorganizmust (III) tenyésztettek, és az illető fermentlében , lévő túlélő (III) mikroorganizmus élő sejtjeit a betáplálás előtt valamilyen felületaktív anyaggal sterilizáljuk. (1) A (II) mutáns deriválása. A feltalálók egy 2,5-diketo-D-glükonsavból 2-keto- L-gulonsav termelésére képes szülő mikroorganizmus törzsből [(I) szülő törzs] származó (II) mutánst kaptak az (1) szülő törzs mutáció előidézésére szolgáló szokásos módon való kezelésével. Ezt a (II) mutánst úgy szelektálták, hogy 5-kelo-D-glükonsavon ne, vagy alig tenyésszen, és 2-keto-D-glükonsav termelésére képtelen legyen.| Ennélfogva itt, és a továbbiakban is úgy definiálható,1 mint „olyan mutáns, amely lényegében defektiv 5-keto- D-glükonsav metabolizálásában, és lényegében képtelen 2-kcto-D-glükonsav termelésére”. Így ha a (II) mutánsj tenyésztési körülmények között 2,5-diketo-D-glükonsav-j val kerül érintkezésbe, akkor 2-keto-L-gulonsav keletke-, zik,és felhalmozódik az elegyben anélkül, hogy egyidejű-, leg a nemkívánt 2-keto-D-glükonsav is felhalmozódná.. Mutáció előidézésre alkalmas bármely szokásos mód-i szer használható a (11) mutánsnak az (I) törzsből való nyerésére. A módszer lehet ultraibolya sugárzásnak, vagy X-sugár hatásának való kitétel és valamilyen mutagénnel, például N-metil-N'-nitro-M-nitrozo-guanidinnel (N.T.G.), 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
