195536. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 2-keto-L-gulonsav előállítására
1 195 536 2 akriflavinnal, metán-szulfonsav-etil-észterrel és hasonlókkal való kezelés. A jelen találmány egyik megvalósítása szerint a kezelt (I) törzs szuszpenzióját először sterilizált fiziológiás sóoldattal alkalmas koncentrációra hígítjuk tetszés szerinti inkubálás után, és a hígított szuszpenzió egy részét (0,5 -1 ml) 0,5—2% D glükonsavat (és vitaminokat, és a mikroorganizmusok növekedése szempontjából esszenciális nyomelemeket is) tartalmazó minimál (agar) táptalajon szélesztjük tenyésztésre. A táptalajon kinőtt telepeket lenyomatos módszerrel átvisszük egy 0,5—2% 5-keto-D-glükonsavat tartalmazó másik minimál (agar) táptalajra, és utána szelektáljuk azokat a telepeket, amelyek nem képesek 5-keto-D-glükonsavval tenyészni. A szelektált telepekben lévő sejtek teljesen elveszítik azt a képességüket, hogy 5-keto-D-glükonsavat hasznosítsanak, amelyet az (I) szülő törzs megtartott, vagy ez a képességük az (I) szülő törzshöz viszonyítva kevesebb, mint 1/10-ére csökken. Bebizonyosodott továbbá, hogy a (II) mutánsok mindegyike 2,5-diketo-D-glükonsav jelenlétében tenyésztési körülmények között lényeges 2-keto-D-glükonsav melléktermék nélkül termel 2-keto-L-gulonsavat. A fent leírt módon nyert (II) mutánsok, például a FERM-BP 108 mutáns, amely a Corynebacterium sp., FERM-P 2770, ATCC No. 31 090 (I) szülőtörzstől származik, a FERM-BP' 107 mutáns, amely a Corynebacterium sp., FERM-P 2687, ATCC No. 31 081 (1) szülőtörzstől származik (lásd 1. táblázat). Ezeknek az (1) szülőtörzseknek a részletes rendszertani leírását a 3 959 076 és 2 998 697 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásokban adják meg. 1. táblázat 2-Keto-L-gulonsavat termelő mikroorganizmusok (szülők) és a belőlük származó, lényegében 5-keto-D- glükonsav metabolizálásában defektiv és lényegében 2-keto-D-glükonsav termelésére képtelen mutánsok. Szülők. Mutánsok. Corynebacterium sp. FERM-P 2770, FERM-BP 108 ATCC No. 31 090 Corynebacterium sp. FERM-P 2687, FERM-BP 107 ATCC No. 31 081. Az az előbb leírt tény, hogy a 2-keto-D-glükonsav termelő aktivitás megszűnése vagy jelentős csökkenése a szülő törzs 5-keto-D-glükonsav metabolizáló aktivitásának megszűnésével együtt jár, minden olyan 2-keto-L- gulonsavat termelő mikroorganizmusra érvényes, amely a baktériumok Coryneform csoportjához tartozik (a Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology 8. kiadásában megadott definíció szerint). Az említett (II) mutánsok bármely további mutánsai vagy változatai alkalmazhatók a közölt eljárás megvalósítására, amennyiben eleget tesznek ennek a követelménynek. Továbbá alkalmazható bármely gén-klónozással, transzformációval vagy sejtfúzióval előállított olyan mikroorganizmus is, amelybe a (II) mutáns ezen jellegét kifejező gént bevitték. (2) 2,5-Diketo-D-glükonsav átalakítása 2-keto-L-gulonsawá a (II) mutáns jelenlétében. Az (I) szülőtörzs tenyésztésénél, a fermentlé kezelésénél, és a 2-kcto-L-gulonsavnak a fermentléből való kinye- < résénél alkalmazott ismert szokásos körülmények bármelyike, amelyeket például a 3 922 194 sz., a 3 959 076 sz., és 3 963 574 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásokban közölnek, hasonlóképp alkalmazható a (II) mutáns tenyésztésére és az ezt követő lépésekre bizonyos lényegtelen módosításokkal. Semmiféle különleges korlátozás nincs a (II) mutánsI tenyésztésére szolgáló táptalaj összetételére. Szénforrásként cukrok, például glükóz, szacharóz és melaszok, polihidroxi-alkoholok, például glicerin, használhatók a, 0,5-5% koncentrációban, nitrogénforrásként pedig szokásos nitrogéntartalmú anyagok, például kukoricalekvár, pepton, húskivonat, nmmóniumsók, nitrátok,; és hasonlók 0,5—5% koncentrációban. A táptalajhoz egyéb szervetlen sók (például kalcium-, magnézium-, kálium-, cink-, mangán- és vassók) vagy a végtermék termelését elősegítő faktorok is adhatók. Az összetétel az alkalmazott törzs tulajdonságaitól, a nyersanyag, a 2,5-diketo-D-glükonsav mennyiségétől és az egyéb kisérő körülményektől függően változhat. A 2,5-diketo-D-glükonsav bármely sójának vizes oldata használható nyersanyagként. Hasonlóképpen megfelelő olyan fermentlé használata is, amelyet D-glükózból 2,5-diketo-D-glükonsav termelésére képes olyan mikroorganizmus tenyésztésével kaptunk, amely az Erwinia vagy Gluconobactcr nemzetséghez tartozik (a Bcrgey's Manual of Determinative Bacteriology 8. kiadásban megadott definíció szerint, és ennélfogva ide tartozik a 7. kiadásban megadottak szerint az Acetomonas, Acetobacter és Gluconobacter nemzetség). A fermentlevet scjlmcntcs szőriéiként vagy vegyszerekkel (például nátrium-dodecil-szulfonáttal) sterilizált oldatként alkalmazzuk. A jelen találmány szerinti eljárás megvalósításában alkalmazott 2,5-diketo-D-glükonsavat termelő (III) mikroorganizmus olyan mikroorganizmus, amely a Gluconobacter vagy Erwinia nemzetségbe tartozik. Ilyen mikroorganizmusokat a 2. táblázatban sorolunk fel példaként. 2. táblázat Mikroorganizmus FERM-P ATCC Acetomonas albosesarnea Gluconobacter melanogeum 2439 21998 IFO 3293 Gluconobacter rubisinosus — — IFO 3244 —Erwinia citreus 5449 31623 Erwinia punctata 5452 31626 Erwinia punctata var. 5450 31624 Erwinia punctata var. 5451 31625 Erwinia punctata var. 5453 31627 Erwinia terreus 5454 31628 Erwinia terreus var. 5455 31629 Erwinia terreus var. 5456 31630 Erwinia terreus var. 5457 31631 A fenti törzsek részletes rendszertani leírása vagy a 3 998 697 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi 3 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
