195535. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szarvasmarha növekedési hormont vagy prehormont meghatározó bázis sorrendet tartalmazó DNS transzfer vektor előállítására
1 195 535 2 kombináns fágokat kiválaszthatjuk oly módon is, hogy in situ plakk hibridizációt végzünk Benton és Davis szerint eljárva [Science, 196, 180 (1977)]. B) Blattner és munkatársai (lásd előbb) szerint eljárva Charon 3A vagy 4A dezoxi-ribonukleinsavat állítunk elő, majd felhasználjuk transzfer vektorként az előzőekben használt Charon 16A dezoxi-ribonukleinsav helyett. Az összes reakciókörülmény a Charon 16A dezoxi-ribonukleinsav használatakor megadottal azonos. A rekombináns fágok szelekcióját a) a fágok Lac+-baktériumokra való szélesztéssel végezzük, amelyek X6-ot tartalmaznak, és színtelen plakkokat izolálunk, majd vagy megfelelő próbával hibrídizálunk, vagy Blattner és munkatársai (lásd előbb) szerint eljárva, restrikciós endonukleázos emésztést végzünk. A beépített szakaszt a fentiek szerint eljárva eltávolítjuk, amikor olyan dezoxi-ribonukleinsavat kapunk, amely 830 bázispár hosszúságú, és amely az 1. ábrán megadott szekvenciát tartalmazza. C) Tiemier és munkatársai szerint eljárva, lambda gt WES • lambda B dezoxi-ribonukleinsavat állítunk elő, és transzfer vektorként használjuk a fentiek során ismertetett Charon 16A helyet. A kísérletet azonos körülmények között végezzük, mint ahogy a Charon 16A esetében leírtuk. A rekombináns fágok szelekcióját Benton és Davis (lásd előbb) hibridizációs módszerével végezzük. A beépített szakaszt kihasítjuk a fentiek szerint eljárva, amikor olyan dezoxi-ribonukleinsav molekulákat kapunk, amelyek 830 bázispár hosszúságúak, és amelyek az 1. ábrán megadott szekvenciát tartalmazzák. D) Az 5A—C. példákban megadottakat ismételjük meg, azzal a különbséggel, hogy az E. coli k 1776 helyett E. coli RRI, E. coli HB101, E. coli DP50 vagy E. coli DP50SupF sejteket használunk. Az összes reakciót a fentiekkel azonos módon végezzük, és azonos eredményeket kapunk. 6. pclda Az 1. példában megadottak szerint eljárva előállítjuk a szarvasmarha pre-növekedési hormonját meghatározó cDNS-t. Hozzákapcsolunk a molekulához Hind III restrikciós linkereket, és az így kapott cDNS-t Hind 111, vagy Hsu I enzimekkel emésztjük, ahogy azt a 4A. példában megadtuk. S. aureus-ból Ehrlich szerint (lásd előbb) pC194 plazmidot izolálunk, és ezt transzfer vektorként használjuk fel. Hind III vagy Hsu I enzimekkel a Hind III helyen hasítjuk a pC194 plazmidot, majd Ullrich és munkatársai (lásd előbb) szerint eljárva alkalikus foszfatázza! kezeljük. A Hind III kohézív végekkel rendelkező cDNS-t hozzákapcsoljuk a hasított pC 194-hez, ahogy azt Ullrich és munkatársai leírják (lásd előbb). Kompetencia indukciót végzünk B. subtilis RUB331 sejtekkel, ahogy azt Sgaramella és munkatársai leírják [J. Mól. Bioi., 105, 587 (1976)], továbbá ahogy azt Borensteln és Ephrati- Elizue közük [j. Mól. Bioi., 45, 137 (1969)]. A B. subtilis RUB331 sejtek transzformációját a ligációs eleggyel végezzük, ahogy azt Sgaramella és munkatársai, és Borenstein és munkatársai (lásd előbb) ismertetik. A sejtszusz - penziót közvetlenül olyan L lemezekre szélcsztjük, amelyek 3 pg kloratufcnikoll tartalmaznak. Egy szelektált rekombinánst izolálunk, és Hind III enzimmel emésztjük, az elegyet ezután a 2. példában megadottak szerint eljárva analizáljuk. 830 bázispár hosszúságú, dezoxi-ribonukleinsavat kapunk, amely az 1. ábrán megadott szekvenciával rendelkezik. 7. példa A szarvasmarha növekedési hormont meghatározó cDNS szintézise A) A pBR348 plazmidot Hae II endonukleázzal emésztjük, amikor egy 1600 bázispárbó! álló fragmenshez jutunk. Egy Hae II helyet találunk a növekedési előhormont meghatározó cDNS beépített szakaszban, egy másodikat pedig a pBR322 plazmid részén. Az emésztéskor az alábbi fragmenseket kapjuk: + 1+2 5' - C TTC ___3' 3' - G CGG AAG .... 5'. A szarvasmarha növekedési hormonja vagy a +1 alaninnal, vagy a +2 fenil-alanin-csoporttal kezdődhet, az amino-terminális végen (Dayhoff és munkatársai, lásd előbb); így teljessé tehető az alanin-kódon, vagy kihasítható. A kihasítást úgy végezzük, hogy a dezoxi-ribonukleinsavat dATP és dezoxi-ribonukleinsav-poiimeráz I-Klenow-fragmcns jelenlétében inkubáljuk, amikor a + 2 fenil-alanin kodon első bázisa (a 3-5’ szálon) A. A reakciót követően az alábbi termékeket kapjuk. + 1 +2 5' - C TTC .... 3' 3' - AAG .... 5'. A dezoxi-ribonukleinsavat fenollal extraháljuk, és kicsapjuk. A fölös mennyiségű dATP-t és az emésztett bázisokat Sephadex G-50 gyantából készült oszlopon kromatografálva távolítjuk el. A visszamaradó 5’-helyzetfl C-t a +1 alanin-kodonról ezután Shine és munkatársai szerint eljárva [Nature, 285, 456 (1980)] Sl-nukieázzal hasítjuk ki. Az emésztést követően az alábbi termékhez jutunk: + 2 5' - TTC .... 3’ 3' - AAG .... 5'. B) A 7A. példában megadottakat ismételjük meg, amelynek során a szarvasmarha előnövekedési hormont meghatározó dezoxi-nukleotid-szekvenciát úgy távolítjuk el, hogy a 3., 4., 5. és 6. példákban megadottak szerint előállított transzfer vektorokat a Hae II-vel kivitelezett 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 10
