195535. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szarvasmarha növekedési hormont vagy prehormont meghatározó bázis sorrendet tartalmazó DNS transzfer vektor előállítására
195 535 2 emésztést megelőzően a megfelelő restrikciós enzimmel hasítjuk. A használt transzfer vektorokat és restrikciós enzimeket a III. táblázatban ismertetjük. III. Táblázat Restrikciós enzim Transzfer vektor (példa) PstI ' 3A., 3B„ 4G., 4H. Hind III 4A.,4B.,6. Sal I 4C„ 4D. Bam HI 4C.,4D. Eco RI 4E..4F., 5A.,5B., 5C. A restrikciós enzimmel való emésztést követően a szarvasmarha előnövekedési hormont meghatározó szekvenciát gél-elektroforézissel izoláljuk, majd ezt követően a 7A. példában megadottak szerint eljárva kezeljük, amiután a fentiekkel azonos eredményt kapunk. C) A 7A. és 7B. példákban megadottakat ismételjük meg, azzal a különbséggel, hogy a dezoxi-ribonukleinsavpolimeráz I-Klenow-fragmcnsc helyett T4 dezoxi-ribonukleinsav-polimerázt vagy 3'-5'-exonukleázt használunk. Az összes többi körülmény azonos, minden egyes esetben a szarvasmarha növekedési hormonját meghatározó szekvenciájú fragmenseket kapunk. 8. példa A) A 7A. vagy 7B. példákban megadottak szerint eljárva Hae II enzimmel végzett emésztéssel előállítjuk az alábbi szarvasmarha növekedési hormon fragmenst: + 1+2 5' - C TTC .........3' 3' - G CGG AAG.........5' A vegyület teljessé tételét az alábbiak szerint végezzük. A dezoxi-ribonukieinsavat dATP, dGTP, dCTP, dTTP és dezoxi-ribonukleinsav-polimeráz I-Klenow-fragmens jelenlétében inkubáljuk. A reakciót követően az alábbi terméket kapjuk: + 1 +2 5' - G GCC TTC .... 3' 3' - G CGG AAG .... 5'. A dezoxi-ribonukieinsavat fenollal extraháljuk és kicsapjuk. Ezután dCTP jelenlétében a dezoxi-ribonukleinsav-polimeráz I-Klenow-fragmensével inkubáljuk a molekulát. Ezután Shine és munkatársai szerint eljárva [Nature, 285, 456 (1980)] Sl-nukleázzal emésztjük, amiután az alábbi terméket kapjuk: 5', - GCC TTC .... 3’ 3' - CGG AAG___5'. B) A 8A. példában megadottakat ismételjük meg, azzal a különbséggel, hogy a második inkubációs lépéskor, azaz, amikor dCTP jelenlétében emésztünk, a Klenowfragmens helyett T4-dezoxi-ribonukleinsav-polimerázt vagy S'-S’-exonukleázt használunk. Az egyéb körülmények azonosak, és minden esetben azonos szarvasmarha növekedési hormont meghatározó szekvenciához jutunk. 9. példa A szarvasmarha növekedési hormont meghatározó dezoxi-nuklcotid-szckvcnciát az előzőekben, a szarvasmarha előnövekedési hormont meghatározó szekvencia kapcsán megadottakhoz hasonlóan eljárva, transzfer ve ktorokba építjük be. A) Az 1., 3A., 3B., 4A-I., 5A-D. és 6. példákban megadottakat ismételjük meg, azzal a különbséggel, hogy a szarvasmarha előnövekedési hormont meghatározó dezoxi-ribonukleinsav helyett a 7A., 7B. vagy 7C. példákban előállított dezoxi-ribonukieinsavat használjuk. Az összes többi körülmény azonos. A dezoxi-ribonuklt insavat a megfelelő restrikciós enzimmel, például a II(. táblázatban megadottakkal végzett emésztéssel hasítjuk ki, és a 2. példában megadottak szerint analizáljuk. Minden esetben olyan dezoxi-ribonukieinsavat kapunk, amely a fenil-alanin-kodont tartalmazza a másod’k helyen, és ezután teljes egészében az 1. ábrán bemutatott szekvenciával folytatódik. B) Az 1., 3A,, 3B., 4A-I., 5A-D. és 6. példákban megadottakat ismételjük meg, azzal a különbséggel, hogy a szarvasmarha előnövekedési hormonját meghatározó d zoxi-ribonukleinsav helyett a 8A. vagy 8B. példákban előállított dezoxi-ribonukieinsavat használjuk. Az összes többi körülmény azonos. A dezoxi-ribonukieinsavat a megfelelő restrikciós enzimmel, például a III. táblázatban megadottakkal hasítjuk ki, és ezt követően a 2. példában megadottak szerint analizáljuk. Minden esetben olyan dezoxi-ribonukieinsavat kapunk, amely az alaninkodonnal kezdődik az első helyen, majd az 1. ábrán megadott szekvenciával folytatódik. 10. példa A szarvasmarha növekedési hormonjának kifejezése A szarvasmarha növekedési hormonját a fentiekben ismertetett módszerek bármelyikével kifejezhetjük. A) A szarvasmarha növekedési előhormon kifejeződését fúziós proteinként radioimmun-méréssel és minisejtkisérlcttel bizonyítjuk. A radioinmmn-méréskor pBP348 plazinidot tartalmazó E. coli k 1776 vagy kontrollként pBP322 plazmidot tartalmazó E. coli sejteket használunk. A sejteket táplevesben szaporítjuk és centrifugálással összegyűjtjük, A sejteket újraszuszpendáljuk, és lizáljuk, majd a növekedési hormonhoz radioaktívan jelzett növekedési hormont és — például szarvasmarha antitestet adunk. Kicsapjuk az immun-komplexet, és meghatároz5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 11
