195535. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szarvasmarha növekedési hormont vagy prehormont meghatározó bázis sorrendet tartalmazó DNS transzfer vektor előállítására
1 195 535 2 B) A 4A. példában megadottakat ismételjük meg, azzal a különbséggel, hogy a pBR322 plazmid helyett több más vektort használunk. A példában a pBR322 helyett pSCIOl, pMB9, pBR313, pBR315 és pBR316 plazmidokat használunk. Az összes reakciókörülmény, továbbá a rekombináns kiónok szelekciója az A. pontban megadottak szerint történik. Az összes plazmiddal azonos eredményt kaptunk, azaz olyan rekombináns plazmidot, amely az 1. ábrán megadott szekvenciájú, beépített szakaszt tartalmaz. C) A 4A. példában megadottakat ismételjük meg, azzal a különbséggel, hogy több más restrikciós linkért, és restrikciós cndonukleá/.t használunk. A példában a Hind III linkerek helyett Sal I és Bam Hl linkereket használunk. Ezeknek a kötőmolekuláknak a bázis-sorrendje a következő: 5'-GGTCGACC-3'- és 5'-CCGGATCCGG-3'. Abban az esetben, ha Sal I linkereket használunk, úgy a linkerrel csatolt cDNS-t, és a pBR322-t Sa! I restrikciós endonukleázzal hasítjuk; abban az esetben, ha Bam Hl linkereket alkalmazunk, úgy a restrikciós endonukleáz Bam Hl. Az összes reakciót, továbbá a rekombináns kiónok szelekcióját a 4A. példában megadottak szerint végezzük. Az összes linker és restrikciós endonukleáz esetén azonos eredményt kaptunk. D) A 4C. példában megadottakat ismételjük meg, azzal a különbséggel, hogy a pBR322 plazmid helyett pSCIOl, pMB9, pBR313, pBR315 és pBR316 plazmidokat használunk. Az összes kísérletet a 4C. példában megadottak szerint végezzük, és azzal azonos eredményeket is kapunk, azaz minden esetben az 1. ábrán megadott szekvenciát tartalmazó beépített szakaszhoz jutunk. E) A 4A. példában megadottakat ismételjük meg, azzal a különbséggel, hogy a Hind HI linker helyett Eco RI restrikciós linkért használunk, amelynek szekvenciája a következő: 5'-CCGAATTCGG-3'; a Hind III (Hsu 1) helyett pedig Eco RI-t használunk. Az összes körülmény az előzőekben megadottakkal azonos, kivéve, hogy a transzformált telepeket nem-tetraciklin-érzékenység alapján szelektáljuk. A klónozott dezoxi-ribontiklcinsav jelenlétét az 1. példában megadottak szerint bizonyítjuk. Egy olyan kiónt kaptunk, amely az 1. ábrán megadott szekvenciájú beépített szakaszt tartalmaz. F) A 4E. pontban megadottakat ismételjük meg, azzal a különbséggel, hogy a pBR322 plazmid helyett pSCIOl, pMB9, pBR313, és pBR3!5 plazmidokat használunk. A 4E. példában megadottak szerint járunk el, és minden plazmid esetén azonos eredményeket kapunk. G) A 4A. példában megadottakat ismételjük meg, azzal a különbséggel, hogy a Hind III linker helyett 5'-GCTGCAGC-3' szekvenciájú Pst I restrikciós linkért és a Hind III (Hsu 1) enzim helyett pedig Pst I enzimet használunk. A reakciókat azonos módon végezzük, azzal a különbséggel, hogy a rekombináns kiónokat az 1. példában megadottak szerint választjuk ki. A rekombináns klón az 1. ábrán megadott szekvenciát tartalmaz. H) A 4G. példában megadottakat ismételjük meg, azzal a különbséggel, hogy a pBR322 helyett pBR315 és pBR316 plazmidokat használunk. A 4G. példában megadott reakciókörülményeket alkalmazzuk, és azonos eredményeket kapunk. I) Az I., 3A., 3B. és 4A-H. példákban megadottakat ismételjük meg, azzal a különbséggel, hogy az E. coli K 1776 helyett E. coli RRI vagy E. coli HB101 sejteket használunk. Az összes kísérletet a megadottak szerint végezzük, és az előzőekkel azonos eredményt kapunk. 5. példa Az 1. példában megadottak szerint eljárva, a szarvasmarha pre-növekedési hormonját meghatározó cDNS-t állítjuk elő. A cDNS-hez Valenzuela és munkatársai (lásd előbb) szerint eljárva végligációval Eco Rí restrikciós linkereket kötünk, és Ullrich és munkatársai szerint (lásd előbb) Eco Rí enzimmel hasítjuk. A) Transzfer vektorként a Blattner és munkatársai (lásd előbb) szerint előállított Charon 16A dezoxi-ribonukleinsavat használunk. A kohézív végeket úgy távolítjuk el, hogy 60 percen át 42 °C hőmérsékleten, 0,1 mólos trisz-hidrogén-klorid (pH = 8,0) és 10 minői magnéziumklcrid segítségével készült reakcióelegyben inkubáljuk. A vektort az Eco Rí restrikciós helyen hasítjuk az Eco Rí endonukleáz segítségével, majd ezután Ullrich és munkatársai (lásd előbb) szerint eljárva alkalikus foszfatázzal kezeljük. Etanolos kicsapást követően hozzáadjuk a foszfatázzal kezelt vektor dezoxi-ribonukleinsavat ahhoz a cDNS-hcz, amely Eco Rí kohézív végeket tartalmaz. Két mól vektorra számítva egy mól cDNS-t adagolunk. A keveréket T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázzal kapcsoljuk össze, ahogy az Ullrich és munkatársai leírják (lásd előbb). A ligációs elegyet közvetlenül E. coli k 1776 sejtekhez adjuk, amelyeket az 1. példában megadottak szerint transzformációra készítettünk elő, a transzformációt az 1. példában megadottak szerint végezzük. Rekombináns fágokat különítünk el, és Lac“-baktériumokra szélesztjük olyan lemezeken, amelyek 5-klór-4-bróm- 3-indolil-/3-D-galaktozidot (X6) tartalmaznak 80 pg/ml mennyiségben. A Charon 16A Eco RI helyére beépült cDNS-t tartalmazó rekombináns fágokat szelektálunk1 szíi télen plakk-ok megjelenése alapján. Egy rekombinánst izoláltunk, és fölös mennyiségű Eco Rí endonukleázzal emésztettük, majd az elegyet a 2. példában megadottak szerint eljárva analizáltuk. Olyan DNS molekulát izoláltunk, amely 830 bázispár hosszúságú, és amelynek bázis-szekvenciája az 1. ábrán megadott. Eljruhatunk oly módon is, hogy a ligációs elegyet használjuk fel rekombináns fágok előállítására oly módon, hogy Sternberg és munkatársai szerint eljárva [Gene, 1, 255 (1977)] in vitro burkoljuk be fágfehérjével. A re-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 9
