195535. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szarvasmarha növekedési hormont vagy prehormont meghatározó bázis sorrendet tartalmazó DNS transzfer vektor előállítására
1 195 535 2 úgy a klónozott nukleotid-szekvencia módosítása általában nem szükséges mindaddig, míg a kapott szekvencia nem gátolja a beépített dezoxi-ribonukleinsav szakasz transzlációját a megfelelő leolvasási fázisban, és nincs jelen „stop kodon” a beépített szekvencia kezdő kodonja előtt. A növekedési prehormon, vagy a növekedési hormon fúziós proteinként fejeződik ki, ha a cDNS-t kifejeződő operonok (expressziós vektorok) megfelelő helyeire építjük be, például az alábbi esetekben: a pBR322 (Maktamáz génjének Pst I helyén [Villa— Komaroff és munkatársai, Proc. Nat. Acad. Sei., USA, 75, 3727 (1978); Serburg és munkatársai, Nature, 274, 795 (1978)]; a lac kontroll szakaszt tartalmazó pBR322 Eco Rí helyén, amely továbbá meghatározza a 0-galaktozidáz enzimet [Itakura, lásd előbb]; továbbá a ptrpED50 plazmid trpD génjében lévő Hind III helyén [Martial és munkatársai, Science, 205, 602(1979)]. A megfelelő leolvasási fázist biztosítva egy vagy két nukleotidot lehasíthatunk vagy módosíthatunk a szekvencián; ezt az irodalomból ismert módszerekkel végezzük. A pBR322 Pst I helyén való beépítés hozzácsatolási módszerrel megfelelő fázisban történik, és a leolvasási irány helyességének valószínűsége 1/6 valószinűséggcl következik be. A fúziós proteinből a növekedési prehormon, vagy a növekedési hormon specifikus, in vitro végzett hasítással állítható elő. A klónozott nukleotid-szekvenciát módosítjuk oly módon, hogy olyan aminosav-szekvenciát határozzon meg, amely proteolitikus enzimre érzékeny szakaszt biztosít. Ilyen szekvencia az AspAspAspAspLys aminosav-szakasz, ezt előnyösen enterokinázzal hasítjuk, ahogy azt a 125 878 számú, 1980. február 29-én közzétett szabadalomban olvashatjuk. A leírás szerint a fenti aminosav-sorrendet meghatározó nukleotid-szekvenciát építünk be a növekedési eiőhormon terriiinális aminosavát meghatározó nukleotid-szekvencia szomszédságába. A növekedési prehormon esetén ilyen beépítéskor az eredeti cDNS molekulát módosítanunk kell oly módon, hogy az 5'-végről nukleotidokat hasítunk le. A növekedési hormont meghatározó cDNS molekula ilyen módosítást nem igényel. A növekedési előhormont meghatározó dezoxi-ribonukleinsav módosítását vagy a molekula 3'-végénck szabályozott emésztésével végezzük S'-cxonukleázzal vagy T4 DNS-polimerázzal, végezhetjük a módosítást azonban restrikciós endonukleázok kombinációjával, a megfelelő startpont 5'-végén lévő helyen, amiután kémiai szintézissel állítjuk vissza a beépíteni kívánt szekvenciát. Az eljárásra vonatkozóan lásd a 125 878 számú amerikai szabadalmi leírást. A fentiek szerint eljárva, előnyösen T4 DNS-polimerázt és Slnukleázt használva olyan cDNS-szekvenciát kapunk, amely a növekedési előhormont határozza meg, és nem tartalmazza az ő’-nem-transzlatált szakaszt. Az előzőekben ismertetett aminosav-szekvenciát meghatározó linker-nukleotid szekvenciát úgynevezett „blunt-végligációval” kapcsoljuk a növekedési előhormont, vagy a növekedési hormont meghatározó cDNS molekulához. A kapcsolást dezoxi-ribonukleinsav-ligázzal végezzük Valenzuela és munkatársai szerint eljárva [Nature, 280, 815 (1979)]. A módosított cDNS molekulát fúziós proteint meghatározó expressziós vektorba építjük be, az előzőek szerint eljárva. A rekombináns vektor, amely hordozza a növekedési hormont meghatározó szakaszt, ezután gazdabaktériumba, például E. coli HB101, RRI vagy K 1776 törzsbe, vagy más baktériumba transzformáljuk. A transzformánsokat ampicillin rezisztencia alapján választjuk ki. Ezután a fúziós protein kifejeződésére alkalmas fermentációs körülmények között tenyésztjük a transzformánsokat. A fúziós protein kifejeződését követően enzimatikus hidrolízissel, előnyösen enterokinázzal hasítjuk ki a növekedési előhormont, vagy a növekedési hormont. , A találmány szerinti növekedési előhormont megfelelő expressziós transzfer vektorok használatát követően közvetlenül kifejezzük, azaz a termék nincs kötve bármely prokariőta proteinhez. A közvetlen kifejezés alapja az, hogy a beépített dezoxi-ribonukleinsav szakasz teljes egészében helyettesít egy olyan szegmenst, amely egyébként a baktérium-szabályozó szakasza által átíródik és leolvasódik. A szabályozó szakasz alapvető fontosságú része a kifejeződő szakasszal határolt, a szabályozó szakasz pedig tartalmaz egy promotert, és egy, a gazdasejtben hatni képes riboszomális kötőhelyet. Nem szükséges a fúziós protein gazdasejt által meghatározott részét kódoló összes nukleotidot eltávoíítanunk. A riboszóma kötőhely és az AUG start kodon közötti összefüggés olyan, hogy a start kodon a riboszóma kötőhely 3—11. nukleotidjához képest bárhol elhelyezkedhet. (Az előzőekre vonatkozóan lásd Shine és munkatársai, Proc. Nat. Acad. Sei., USA, 71, 1342, 1974; és Steitz, Proc. Nat. Acad. Sei., USA, 72, 4734, 1975.) A 3-11. nukleotidot tartalmazó szakaszban az első AUG meghatározza a transzláció leolvasási fázisát. Esetünkben az előzőekben ismertetett ptrpED50-ből származó ptrpE30, az operátorral, promoterral, attenuator és a triptofán operon riboszóma kötőhelye, továbbá a trpE protein hét aminosavát meghatározó nukleotid-szekvencia és az ezt követő Hind Hl hely oly módon biztosít kedvező lehetőséget s cDNS beépítésére a triptofán operon szabályozása alá, hogy a Hind III helyből legkevesebb 23 -29 nukleotidot kihasítunk. A növekedési eiőhormon közvetlen kifejezésére az eredeti cDNS molekulát a fentiek szerint módosítjuk az S'-nem transzlatált szakasz eltávolítására. Közvetlen kifejezésre vektort úgy állíthatunk elő, hogy a fentiek szerint T4 dczoxl-ribonukleinsav-polimerázzal és Slnuklcázzal 23-29 nukleotidot kihasítva módosítjuk a ptrpE30 vektort. A módosított cDNS molekula mindkét végéhez Bam Hl-endonukleáz által felismert linker nukleotid-szekvenciát kapcsolunk, ugyanezt kapcsoljuk hozzá a ptrpE30-hoz. (Az eljárást Valenzuela és munkatársai szerint végezzük, lásd előbb.) Ezt az Ullrich és munkatársai [Science, 196, 1313 (1977)] által ismertetett beépítés megkönnyítésére végezzük. A beépített növekedési előhormont meghatározó szakaszt hordozó rekombináns vektorokkal ezután megfelelő gazdasejtet, például E. coli HB101, RRI, vagy k 1776 törzset vagy más baktériumot transzformálunk. A transzformánsokat az ampicillin rezisztencia alapján szelektáljuk, majd a növekedési eiőhormon kifejeződéséhez kedvező körülmények között tenyésztjük. A növekedési hormont Goeddel és munkatársai szerint eljárva [Nature, 281, 544 (1979)] közvetlenül kifejezhetjük. A növekedési hormont meghatározó cDNS 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
