195535. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szarvasmarha növekedési hormont vagy prehormont meghatározó bázis sorrendet tartalmazó DNS transzfer vektor előállítására
1 195 535 2 molekulához hozzákötünk egy Bam Hl helyet, és az AUG start kodont. Ezt a módosított cDNS molekulát ezután ptrpE30-ba építjük be. A növekedési előhormont növekedési hormonná alakítjuk át oly módon, hogy a szignál pepiidet tartalmazó N-terminális hidroíob aminosavakat lehasítjuk. A szignál peptid in vitro eltávolítását oly módon végezzük, hogy a transzformált, indukált sejtekből extrahált proteint Jackson és Blobel szerint [Proc. Nat. Acad. Sei., USA, 74, 5598 (1977)] mikroszóma preparátummal kezeljük. A szignál peptid in vivo eltávolítását végezhetjük a növekedési előhormont meghatározó szekvencia direkt bakteriális kifejeződése alatt is. A bakteriális és emlős szignál peptidek szekvenciája közel azonos. Az emlős szignál peptideket tartalmazó proteineket bakteriális sejtekkel is előállíthatjuk, amikor a növekedési hormon a periplazmatikus térbe, vagy a táptalajba kerül. Az előzőek szerint szintetizált növekedési előhormont és növekedési hormont az irodalomból jól ismert módszerekkel tisztítjuk, például gélszűrésscl, ioncserés kromaíográfiával, affinitás-kromatográfiával és különböző oldhatósági különbségeken alapuló módszerekkel. A találmány szerinti eljárást a továbbiakban példákkal szemléltetjük. A példákban ismertetett eljárások során a restrikciós endonukleázokkal való emésztést az enzimekre optimalizált körülmények között végezzük. A restrikciós endonukleázokat, nevezéktanukat és helyspecifitásukat Roberts írta le [Crit. Rév. Biochem., 4, 123 (1976)]. Az enzimeket vásároltuk (New England Biolabs., Cambridge, Massachusetts), az optimális reakciókörülményeket az eladó javaslatai alapján állítottuk be, kivéve, ha másként nem jelezzük. A reverz transzkriptáz. enzimet dr. Beard adta [Lire Sciences, Inc., St. Petersburg, Florida], A reverz transzkriptáz használatát, és a megfelelő reakciókörülményeket Seeburg és munkatársai írták le [Nature, 276, 795 (1978); Seeburg és munkatársai, mint fent; továbbá Shine és munkatársai, mint fent], A T4 dezoxi-ribonukleinsav-polimerázt a New England Biolabs, állította elő. A T4 dezoxi-ribonukleinsav-polimeráz használatát és a megfelelő reakciókörülményeket a 125 878 sorszámú leírásban találjuk meg. A micrococcus eredetű Sl-nukleázt a Miles Laboratories, Elkhart, Indiana, állította elő. Az Sl-nukleáz használatát és a megfelelő reakciókörülményeket Ullrich írta le (lásd előbb). A terminális dezoxi-nukleotid-transzfcráz.t az En/.o Biochcmicals, New York, New York, állította elő. Ennek az enzimnek a használatát és a megfelelő reakciókörülményeket Roychoudhury és munkatársai közük (lásd előbb). A dezoxi-ribonukleinsav-poümeráz I-Klenow-fragmensét a Boehringer Biochemicals, Indianapolis, Indiana, állította elő. 1. példa A szarvasmarha növekedési előhormon cDNS-ének szintézise Közvetlenül leölést követően összegyűjtünk nőstény szarvasmarhából származó agyalapi mirigyeket, és azonnal folyékony nitrogénben fagyasztjuk. Az agyalapi mirigyek guanidin-tiocianátos oldatát homogenizáljuk, és a teljes ribonukleinsavat Chirginwin és munkatársai módszere szerint [Biochem., 18, 5294 (1979)] izoláljuk. 5,7 mólos cézium-kloriddal centrifugáljuk a ribonukleinsavat (lásd Ullrich és munkatársai, lásd előbb). Ezután fenollal extraháljuk a ribonukleinsavat és etanollal kicsapjuk. A poli-adenilezett ribonukleinsavat oligo-dT- cellulózzal végzett affinitás-kromatográfiával tisztítjuk, ahogy azt Miller és McCarthy leírja (lásd előbb), továbbá ahogy Aviv és Leder munkájából ismerjük [Proc.Nat. Acad. Sei., USA, 69, 1408 (1972)]. A poli-adenilezett ribonukleinsavat nyúlból származó retikulocitákkal kialakított sejtmentes rendszerben transzlatáljuk [lásd Miller és McCarthy, mint fent; továbbá Martial és munkatársai, mint fent (1977)]. A rendszerben szintetizált szarvasmarha növekedési előhormont heterológ anti-növekedési hormon antiszérummal immun csapadékképzéssel elkülönítjük, és formaliníal fixált Staphylococcus aureus Cowan I sejteken való, adszorpcióval izoláljuk Marial és munkatársai szerint [lásd előbb (1977)]. Az S3S-protcincket 12,5 %-os •íátriuin-dodccil-szulfáfból készült poliakrilamid gélen dektroforézisnek vetjük alá, ahogy azt Laemmü leírja: (lásd előbb). Az analízis szerint a szarvasmarha növekedési ' előhormont meghatározó poli-adenilezett ribonukleinsav a teljes agyalapi mirigy poli-adenilezett ribonukleinsavának 12,6%-a. A poli-adenilezett ribonukleinsavat reverz transzkriptázzal egyszálú cDNS-sé alakítjuk Miller és McCarthy módszere szerint (lásd fentebb), és Monahan és munkatársai szerint eljárva (lásd fentebb). A ribonukleinsavat alkalikus hidrolízissel távolítjuk el. Az egyszálú cDNS molekulákat fenollal extraháljuk, G-50 Sephadex ‘(Pharmacia, Inc., Uppsala, Svédország) gyantából készült oszlopon kromatografáljuk, és etanollal kicsapjuk. Ezt az egyszálú cDNS terméket önmaga priméreként használjuk fel a második cDNS szál előállítására, a szintézist a fentiek szerint reverz transzkriptázzal végezzük. Az első cDNS szál egyszálú, 3'-végen lévő nyúlványát Slnukleázzal emésztjük, ahogy azt Leong és munkatársai (lásd előbb) és Ullrich és munkatársai (lásd előbb) leírják. A kétszáiú cDNS terméket fenollal extraháljuk, Sephadex G-50 gyantából készült oszlopon kromatografáljuk és etanollal kicsapjuk. Ezt a kétszáiú cDNS terméket dCTP és terminális transzferáz jelenlétében 3' dCMP véggel látjuk el, ahogy azt Roychoudhury és munkatársai (lásd előbb) leírják. A pBR322 plazmidot Pst 1 cndouuklcázzal hasítjuk, és az előzőekben ismertetett módon, azzal a különbséggel, hogy a dCTP helyett dGTP-t használunk, végeihez dGMP-t kapcsolunk. 50 ng ilyen dG-végű, Pst I enzimmel hasított pBR322 plazmidot és 20 ng dC-véggel ellátott kétszáiú cDNS-t keverünk 50 jul Cook és munkatársai által ismertetett (lásd előbb) reakcióelegyben. Az E. coli K 1776 törzset transzformáljuk a plazmidkészítménnyel az alábbiak szerint. Az E. coli k 1776 sejteket DNS-re permeábilissá tesszük oly módon, hogy 75 mmól kalcium-kloridot, 5 mmól magnézium-kloridot, 10 mmól, 7,5 pH-jú trisz-puffert tartalmazó reakcióelegyben 20 percen át 4 °C hőmérsékleten tartjuk. A plazmidot es a baktériumokat 60 percen át 4 C hőmérsékleten inkubáljuk, majd 2 percen át 40 °C-on. A transzformált telepeket tetraciklin rezisztenciára szelektáljuk. A klónozott dezoxi-ribonukieinsav jelenlétét telcphidridizációval határozzuk meg, frissen elő5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
