195534. lajstromszámú szabadalom • Eljárás polipeptid előállítására bakteriális úton, triptofán promotor-operátor alkalmazásával
1 195 534 2 motor) hatására fejezi ki, a 6. ábrán (22) jelzéssel ellátott szerkezet, amelyet pHGH 207-tel jelöltünk, a triptofán promotor-operátor irányításával teszi lehetővé a tctraciklinnel szembeni ellenállást biztosító gén expresszióját. Az összekapcsolt elegyet tehát Escherichia coli 294 törzsbe vittük át, és a megfelelő tenyészeteket 5 pg/ml tetraciklint tartalmazó LB táptalajlemezeken választottuk ki. Annak érdekében, hogy igazoljuk az emberi növekedési hormonnak a pHGH 207 plazmidból való közvetlen képződését, az Escherichia coli 294/pHGH 207 baktériumoknak az összes sejtfehérjéjét nátrium-dodecilszulfát gélelektroforézisnek vetettük alá az I. részben fentebb ismertetett módon, és összehasonlítottuk a korábban mások által előállított [D. V. Goeddel és munkatársai, Nature, 281, 544 (1979)] emberi növekedési hormonra kapott hasonló elektroforézis adatokkal. Az Escherichia coli 294/pHGH 207 baktériumokat 10 jug/ml ampicillint tartalmazó LB táptalajon addig tenyésztettük, amíg az optikai sűrűség értéke 1 nem lett, majd 10-szeres mennyiségű M9 táptalajjal hígítottuk, és ismét addig tenyésztettük, amíg az optikai sűrűség értéke 1 nem lett. A 7. ábrán a kapott, megfestett gél fényképe látható. Az 1. és 7. oszlop különböző ismert méretű fehérjejelzőket tartalmaz. A 2. oszlop kontroll, az Escherichia coli 294 pBR322 törzs összes sejtfehérjéje elkülönítésének felel meg. A3, oszlop az LB táptalajon tenyésztett Escherichia coli 294/pHGH 107 törzsből elkülönített fehérjének, a 4. oszlop M9 táptalajon tenyésztett Escherichia coli 294/pHGH 107 törzsből elkülönített fehérjének, az 5. oszlop LB táptalajon tenyésztett Escherichia coli 294/pHGH 207 törzsből elkülönített fehérjének, míg a 6. oszlop M9 táptalajon tenyésztett Escherichia coli 294/pHGH 207 törzsből elkülönített fehérjének felel meg. A 6. oszlopban a sűrű sáv az emberi növekedési hormon (HGH), amint azt a 2-4. oszlopokban látható hasonló sávokkal történő összehasonlítás mutatja. A találmánynak megfelelően, a triptofánban gazdag LB táptalajon tenyésztett Escherichia coli 294/pHGH 207 organizmus kevesebb emberi növekedési hormont termel a triptofán vlsszatartó/operátor kölcsönhatások miatt, és az M9 táptalajon történő tenyésztéskor lényegesen több emberi növekedési hormont termel, mint az Escherichia coli 294/pHGH 107. Ennek oka az, hogy az erősebb triptofán promotor-operátor rendszer indukálódik a pHGH 107 plazmidban meglévő lac promotoroperátor rendszeren keresztül. III. Általános termelő plazmid kialakítása heterológ géneknek a triptofán promotor-operátor irányításával történő közvetlen expressziójára Az előző részben kialakított pHGH 207 plazmidot ezután felhasználtuk olyan DNS töredék előállításához, amely a triptofán operon szabályozó elemeit tartalmazta (a csillapító kiiktatása mellett), és olyan plazmid „kifejezési vektort” állítottunk elő, amely alkalmas különféle szerkezeti génbetétek közvetlen termelésére. Az általános expressziós plazmid kialakítása során eltávolítottuk a triptofán szabályozó tartományt a pHGH 207 plazmidból EcoRI-vel történő feltárással és a fenti 10 X I. részben alkalmazott, EcoRI-vel feltárt pBRHl plazmidba illesztettük be. A pBRHl plazmid, amint azt korábban említettük, ampiciilinnel szemben rezisztens plazmid, amely tartalmazza a tetracikllnnel szembeni rezisztenciához szükséges gént is, azonban érzékeny tetraciklinre, mivel hiányzik belőle a megfelelő promotor-operátor rendszer. A létrejövő pHKYl plazmid, amelynek a szerkezetét közelebbről az alábbiakban írjuk le, és a 8. ábrán mutatjuk be, mind ampiciilinnel, mind pedig tetraciklinnel szemben rezisztens. Tartalmazza a triptofán promotor-operátor rendszert, hiányzik belőle a triptofán csillapító és rendelkezik egyetlen Xbal hellyel, távol a triptofán promotor-operátortól. A triptofán promotor-operátort és az egyetlen Xbal helyet EcoRI helyek kötik, úgy, hogy a promotor-operátor-Xbaliartalmú töredék eltávolítható más szerkezeti gént tartalmazó plazmidokba való beillesztéshez. Úgy is eljárhatunk, hogy heterológ szerkezeti géneket hozzáillesztünk vagy az Xbal helyhez vagy (EcoRI-vel történő részleges feltárás után) a triptofán szabályozó tartománytól távoleső EcoRI helyhez. Mindkét esetben a triptofán promotor-operátor rendszer irányítása alá kerül a beillesztett heterológ szerkezeti gén. A pHGH 207 plazmidot EcoRI-vel kezeltük és a (23) EcoRI töredéket tartalmazó trp promotort poliakrilamidgél-elektroforézissel és elektroelúcióval kinyertük. A pBRH 1 plazmidot EcoRI-vel kezeltük és az elhasított végeket 1 pg bakteriális alkálikus foszfatázzal (BAP) kezeltük (50 mM trisz, pH — 8 és 10 mM magnéziumklorid jelenlétében), 65 °C-on 30 percig. Ily módon eltávolítottuk az EcoRI végeken túlnyúló foszfát-csoportokat. A bakteriális alkálikus foszfatáz feleslegét fenolos extrakcióval, kloroformos extrakcióval és etanolos kicsapással távolítottuk el. A képződő (7a) lineáris DNS - mivel hiányoznak a túlnyúló foszfát-csoportjai - csak olyan betétekkel kapcsolható össze, amelyek kiegészítő „tapadós" végei foszforilezettek, azonban önmagukkal nem kapcsolódnak. Ez lehetővé teszi az illesztéseket tartalmazó plazmidok egyszerűbb elkülönítését. A pHGH 207 plazmidból származó EcoRI töredéket és a pBRHl plazmidból nyert lineáris DNS-t T4 ligáz jelenlétében elegyítettük a korábban leírt módon és összekapcsoltuk. A kapott elegy egy részét az ismertetett módon Escherichia coli 294 törzsbe transzformáltuk, a törzset 5 pg/ml tetraciklint tartalmazó LB táptalajra oltottuk és 12, tetraciklinnel szemben rezisztens tenyészetet kiválasztottunk. Az egyes tenyészetekből elkülönítettük a plazmidot és megvizsgáltuk a DNS beillesztés jelenlétét EcoRI és Xbal alkalmazásával végzett restrikciós endonukleáz analízissel. A beillesztést tartalmazó egyik plazmidot pHKYl jelöléssel láttuk el. IV. Triptofán operont tartalmazó olyan plazmid kialakítása, amely képes a trp vezető polipeptid 6 aminosavját és atrpE polipeptid utolsó harmadát (LE' jelölésű) és egy heterológ szerkezeti gént tartalmazó, specifikusan hasítható fúziós fehérje kifejezésére Az LE' fúziós fehérjét termelő plazmid kialakítása a következő lépésekből állt: a) Olyan géntöredék kialakítása, amely a kódolt ág 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
