195534. lajstromszámú szabadalom • Eljárás polipeptid előállítására bakteriális úton, triptofán promotor-operátor alkalmazásával
1 195 534 2 5' illetve 3' végén Bgl II, illetve EcoRI „tapadós” végeket tartalmazó LE* polipcptid távoli részére vonatkozó kódonokat foglal magába. b) Az LE' géntöredék távoli részéből a kódonok eltávolítása és a trp D génre vonatkozó kódonok eltávolítása a Som7A2 plazmidból, az első lépésben kapott töredék beillesztése, az LE' kódon szekvencia újbóli kialakítása közvetlenül a szomatosztatin heterológ génjére vonatkozó kódon szekvenciája után. Az alábbiakban ismertetett eljárást a 9a ábrán mutatjuk be. A pSom7A2 plazmidot Hind III enzimmel, majd lambda exonukleázzal (5’ -* 3' exonukleáz) kezeltük olyan körülmények között, hogy a hasítás a Bgl II restrikciós helyen túl. az LE' kódoló tartományon belül menjen végbe. 20 y.g, Hind III enzimmel kezelt pSom7 A2 plazmidot puffer-oldatban oldottunk. A puffer 20 mM glicin puffert, pH = 9,6; 1 mM magnéziumkloridot és 1 mM béta-merkapto-etanolt tartalmazott. A kapott elegyet 5 egység lambda exonukleázzal kezeltük 60 percig szobahőmérsékleten. A reakcióelegy et ezután fenollal extraháltuk, kloroformmal extraháltuk, majd etanollal kicsaptuk. Végül, az EcoRI maradéknak az LE' géntöredék távoli végén történő kialakítására egy 33 PCCTGTGCATGAT alaprészt szintetizáltunk a javított foszforsav-triészteres módszerrel [R. Créa és munkatársai, Proc. Nat. Acad. Sei. USA. 75, 5765 (1978)]. és az alaprészt a lambda exonukleázzal végzett hasításnál képződő LE' géntöredék egyszálú végéhez hibridizáltuk. A hibridizálást az alábbiakban ismertetett módon végeztük. A pSom7 A2 plazmid lambda exonukleázzal kezelt Hind 111 hasítási termékét (20 pg) 20 pl vízben oldottuk és hozzáadtuk körülbelül 80 pikomol 5'-foszforilezett fenti oligonukleotidot tartalmazó 6 pl oldathoz. A szintetikus töredéket az LE' kódolt szekvencia 3' végéhez hibridizáltuk, és az LE' töredék fennmaradó egyágú részét a Klenow polimeráz I enzimmel kezeltük a fentebb ismertetett módon, dATP, dTTP, dGTP és dCTP alkalmazásával. A rcakcióclcgyct 50 °C-ra melegítettük, majd hagytuk, hogy lassan 10 °C-ra hűljön le, és 4 pl Klenow enzimet adtunk hozzá, 15 percig inkubáltuk szobahőmérsékleten, majd 30 percig 37 sC-on. A reakciót 5 pl 0,25 mólos etilén-diamino-tetraecetsav hozzáadásával állítottuk le. A rcakcióclcgyct fenollal cxtraháltuk, kloroformmal extraháltuk és etanollal kicsaptuk. A DNS-t ezután elhasítottuk a Bgl II restrikciós enzimmel. A töredékeket poliakrilamidgél-elektroforézissel különítettük el. A gélről felvett autoradiogramm egy 33 P izotóppal jelzett töredéket mutatott, amelynek a várt hosszúsága körülbelül 470 bázispár volt. Ezt a töredéket elektroelűcióval különítettük el. Ennek az LE' (d) töredéknek egy Bgl II és egy „tompa" vége van, amely egybeesik az alaprész kezdetével. A fenti I. C. részben leírt pThal plazmid a timozin alfára vonatkozó szerkezeti gént hordozza, amelynél a kódolt ág 5' vége egy EcoRI helyhez, a 3' vége pedig egy BamHI véghez van klónozva. Amint a 9. ábrán látható, a timozin gén Bgl II helyet is tartalmaz. A pThal plazmid egy olyan gént is magába foglal, amely ampicillinnel szembeni rezisztenciát biztosít. Abból a célból, hogy a fentebb ismertetett módon előállított LE' (d) töredék befogadására alkalmas plazmidot hozzunk létre, a p l hal plazmidot EcoRI-val hasítottuk, majd Klenow polimeráz I enzimmel reagáltattuk, dTTP és dATP alkalmazásával. Ilymódon az EcoRI ma-adékokat „tompává" alakítottuk. \ kapott termék Bgl II-vcl való kezelése a (33) lineáris DNS töredéket eredményezte, amely tartalmaz egy ampicillinnel szembeni rezisztenciát biztosító gént, a szemközti végeken pedig egy „tapadós" Bgl II maradékot és egy „tompa” véget. A képződött terméket a Bgl II „tapadós" véget és „tompa” véget tartalmazó LE’ (d) töredékkel reagáltattuk T4 ligáz jelenlétében. Ekkor a pTrp24 plazmidot kaptuk (9b ábra). Ennek során újra kialakult egy EcoRI hely abban a helyzetben, ahol a „tompa" vég összekapcsolása történt. A pTrp24 plazmidot egymást követően Bgl II-vel és EccRI-vel feltártuk, majd poliakrilamidgél-elektroforézist és elektroelúciót végeztünk. így egy olyan töredéket kaptunk, amelynek kódonjai az LE' (d) polipeptidre vonatkoznak, rendelkezik egy Bgl 11 „tapadós” véggel és rgy EcoRI „tapadós” véggel a 3' kódolt végződésének a szomszédságában. Az említett műveleteket a 10. ábrán mulatjuk be. A (38) LE' (d) töredék a pSom7 A2 plazmid Bgl II helyéhez klónozható, és ekkor egy LE' polipeptid/szomatosztatin összekapcsolt fehérje képződik, a triptofán pro uotor-opcrátor irányítása mellett, a 10. ábrán látható módon. Ehhez szükség volt : ) a pSom7 A2 plazmid EcoRI-vel történő részleges hasítására, annak érdekében, hogy lehasítsuk a triptofán pro motor-operátortól távoleső EcoRI helyet, amint az a 10. ábrán látható, és ') az alaprész szekvenciájának megfelelő megválasztására (9. ábra), annak érdekében, hogy megfelelően megtartsuk a kódon-leolvasható keretet és újra kialakítsunk egy EcoRI hasítási helyet. 6 jug pSom7 A2 plazmidot 200 ptl puffer-oldattal hígítottunk és 0.5 egység EcoRI enzimmel kezeltünk. A puffer-oldat 20 mM íriszt, (pH = 7,5). 5 mM magnéziumkloridot, 0,02 mM NP40 detergenst és 100 mM nátnumkloridot tartalmazott. A reakcióelegyet 15 percig tartottuk 37 °C-on, majd fenollal extraháltuk, kloroformmal extraháltuk, etanollal kicsaptuk és Bgl II enzimmel kezeltük. A kapott nagyobb töredéket — (36) jelzésű a 10. ábrán poliakrilamidgél-clcktroforézissel és elektroelűcióval elkülönítettük. Ez a töredék tartalmazza az „LE’ (p)" kódonokat, amelyek az LE' polipeptid közelebbik végére, azaz a Bgl II helytől felfelé eső végre vonatkozik. A (36) töredéket ezután a (38) töredékhez kapcsoltuk T4 DNS ligáz jelenlétében. Az így kapott pSom7 A4 plazmid a korábban ismertetett módon az Escherichia coli 294 törzsbe transzformálva hatékonyan termelt a triptofán promotorope átor irányításával egy olyan összekapcsolt fehérjét, amely a teljes újraalakított LE' polipeptidet és szomatosztaHnt tartalmazza. A fúziós fehérjét — amelyből a szomatosztatin specifikus módon lehasítható annak következtében, hogy a szomatosztatin szekvencia 5' végénél metionin van jelen — nátrium-dodecil-szulfátos poliakrilamidgélelektroforézissel választottuk el a korábban leírt módon. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 11
