195534. lajstromszámú szabadalom • Eljárás polipeptid előállítására bakteriális úton, triptofán promotor-operátor alkalmazásával
I 195 534 ? önmagában ismert módon állítottuk elő', és a pGI16 plazmid [D. V. Goeddel és munkatársai. Nature, 281, 544 (1979)] EcoRI és BamHI helyeibe klónoztuk. Az így képződött pHS32 plazmidot (ATCC 31 344) Xbalval elhasítottuk, fenollal extraháltuk, kloroformmal extraháltuk és ctanollal kicsaptuk. Ezután 1 pl F.sclicrlchia coli polimeráz I Klcnow töredékkel (gyártó Bochrringer, MannJieiin) kezeltük 0,1 millimól dTTP-t és 0,1 millimól dCTP-t tartalmazó 30 pl polimeráz pufferoldatban (50 millimól káliumfoszfát, pH = 7,4; 7 millimól magnéziumklorid és 1 millimól béta-merkaptoetanol) 30 percig 0 °C-on, majd 2 órán át 37 °C-on. E kezelés hatására az Xbal hasítási helynek az 5’ végnél kinyúló részénél lévő 4 nukleotid közül 2 nukleotid beépül a 3' véghez: 5' CTAGA-5' CTAGA——> 3' T-3' TCT Két nukleotid - dC és dT - beépült, és az 5' végnél így két kinyúló nukleotid maradt. Ezt a plazmid pHS32-ből származó lineáris maradékot fenolos és kloroformos extrakció, majd etanolos kicsapás és vizes közegből való kinyerés után EcoRI-vel hasítottuk. Az 5. ábrán (13) jelzésű nagy plazmidtöredéket poliakrilamidgél-elektroforézissel elválasztottuk a kisebb EcoRI-Xbal töredéktől, és elektroelúció után elkülönítettük. A pHS32 plazmidból nyert ezen DNS töredéket (0,2 /ug) a fentebb ismertetett körülmények között összekapcsoltuk a triptofán operon EcoRI-Taq I töredékével (~0,01 pg) az 5. ábrán‘látható módon. Ennél a lépésnél a Taql kinyúló részt összekapcsoltuk az Xbal-nál megmaradó kinyúló végződéssel, jóllehet az nem volt teljesen Watson—Crickféle bázispárral ellátott:-T CTÁGA-TCTAGA + ------>■-AGC TCT-AGCTCTA fenti összekapcsolási reakcióelegy egy részét az I. részben fentebb ismertetett módon átvittük Escherichia coli 294 törzs sejtjeibe, a sejteket hőkezeltük és ampicillint tartalmazó LB táptalajlemezeken tenyésztettük. 24 tenyészetet választottunk ki, ezeket 3 ml LB táptalajon tenyésztettük és a plazmidot elkülönítettük. Közülük hatnál tapasztaltuk azt, hogy az Xbal hely regenerálódott az Escherichia coli által katalizált DNS párképzés és replikáció útján:-TCTAGA-TCTAGA—--AGCTCT— AGATCTAzt is megfigyeltük, hogy ezek a plazmidok mind EcoRI, mind Hpal hatására hasadnak, és a várt restrikciós töredékeket szolgáltatják. Az 5. ábrán (14) jelzéssel ellátott pTrp 14 plazmidot használtuk heterológ polipeptidek expressziójára, a későbbiekben ismertetett módon. A pHGH 107 plazmid (ATCC 31538; a 6. ábrán (18) jelzésű) [D. V. Goeddel és munkatársai. Nature, 281, 544 (1979)] az emberi növekedési hormonra vonatkozó gént tartalmaz, amely 23, szintetikus DNS töredékekből létrejött aminosav kódonból és 163 olyan aminosav kódonból áll, amelyek az emberi növekedési hormon üzenethordozó RNS fordított átírásával képződött ki- 5 egészítő DNS-ből származtak. Ez a 6. ábrán (21) jelzésű gén amelyből bár hiányoznak az emberi növekedési hormon „elő" szekvenciájának kódoltjai tartalmaz egy ATG lefordítás-kiváltó kódont. A gént 10 pg pHGH 107 plazmidból különítettük el 10 EcoRI kezeléssel, majd Escherichia coli polimeráz I Klenow töredékkel, dTTP-vel és dATP-vel történő kezeléssel Fenolos és kloroformos extrakció, majd etanolos kicsapás után a plazmidot BamlH-vel kezeltük. Lásd a 6. ábrát. 10 Az emberi növekedési hormon (HGH) génjét tartalmazó a 6. ábrán (21) jelzésű töredéket poliakrilamidgélelektroforézissel (PAGE), majd azt követően elektroelúcióval különítettük el. A kapott DNS töredék a tetra- 2Q ciklinucl szembeni rezisztenciát biztositó szerkezeti gén első 350 nuklcotidjál is tartalmazza, hiányzik azonban belőle a tetraciklin promotor-operátor rendszer úgy, hogy ha később egy expressziós plazmidba klónozzuk, az e bevitt részt tartalmazó plazmidok a tetraciklinnel „„ szembeni rezisztencia visszaállítása alapján azonosíthatók. Mivel a (21) töredék EcoRI végét kitöltöttük a Klcnow polimeráz I enzimmel végzett kezeléssel, a töredék egy ,,tompa’’ és egy „tapadós” véggel rendelkezik. Ez biztosítja a megfelelő orientációt, ha később 30 egy expressziós plazmidba visszük be. Lásd a 6. ábrát. Ezután a fenti HGH géntartalmú töredék befogadásához előkészítettük a pTrpl4 expressziós plazmidot. A pTrpl4 plazmidot Xbal-val feltártuk, a képződött „tapadós" végeket kitöltöttük a Klcnow polimeráz 1 35 enzimes kezeléssel, dATP. dTTP, dGTP és dCTP alkalmazásával. Fenolos és kloroformos extrakció és etanolos kicsapá; után a kapott, a 6. ábrán (16) jelzésű DNS-t BamHI-vel kezeltük. A képződött, a 6. ábrán (17) jelzésű nagy plazmidtöredéket poliakrilamidgél-elektro- 40 forézissel és elektroelúcióval különítettük el. A pTrpl4 plazmidból eredő (17) töredéknek egy „tompa" és egy „tapadós” vége van, amelyek lehetővé teszik a fentebb leírt (21 ) töredéket tartalmazó HGH génnel a megfelelő orientációban történő rekombinációt. 45 A (21) HGH géntöredéket és a (17) pTrpl4AXba- , BamHI töredéket egyesítettük és összekapcsoltuk a fentebb leírtakhoz hasonló módon. A kitöltött Xbal és EcoRI végeket összekapcsoltuk a „tompa” végek összekapcsolásával, és így ismét kialakítottuk mind az 50 Xbal, mind az EcoRI helyet: —1 Xbai kitöltés 55 -TCTAG +-AGATC 60 EcoRI kitöltés AATTCTATGTTAAGATACHGH gén kiváltás-TlCTAClAATTCTATG- AG ATCjTT AAJGATAC— Xbal EcoRI Ez a szerkezet a tetraciklinnel szembeni ellenállást! biztosító gént is ismét kialakítja. Mivel a pHGH 107 plazmid a tetraciklinnel szembeni ellenállóképességet 65 a HGH géntől felfelé elhelyezkedő promotor (lac pro-9
