195534. lajstromszámú szabadalom • Eljárás polipeptid előállítására bakteriális úton, triptofán promotor-operátor alkalmazásával
1 195 534 2 restrikciós enzimeket alkalmaztuk és kettős elbontást végeztünk. A kívánt orientációjú trp promotor-operátor töredékkel rendelkező, pSOM7A2 jelölésű plazmidot — (11) jelzésű a 2. ábrán — tartalmazó Escherichia coli 294 baktériumokat 10 pglml ampicillint tartalmazó LB táptalajon tenyésztettük. A sejtek tenyésztését addig végeztük, amíg az optikai sűrűség 550 nm hullámhosszúságnál 1 nem lett, majd centrifugálással elkülönítettük a sejteket és M9 táptalajon szuszpendáltuk őket. A táptalajt 10-szeres hígításnak megfelelő mennyiségben vettük. A tenyésztést 2-3 órán át folytattuk, ismét 1 értékű optikai sűrűség eléréséig, majd elbontás után a teljes sejtfehérje mennyiségét analizáltuk SDS (nátrium-dodecil-szulfát) karbamid (15%) poliakrilamidgél-elektroforézissel. [J. V. Maizei Jr. és munkatársai, Meth. Viral, 5. 180-246(1971)]. A 3. ábra fehérje gélanalízisét mutatja be, amelynél a különböző tenyészetekből kapott össz-fehérjét a méret alapján szétválasztottuk. Az egyes sávok sűrűsége jelzi az illető jelenlévő fehérjék mennyiségét. A 3. ábrán az 1. és 7. oszlop kontrollként szolgál, és különböző, korábban meghatározott méretű fehérjékre vonatkozik összehasonlítási célokra. A 2. és 3. oszlopon pSom7A2 plazmiddal átalakított és LB táptalajon (2. oszlop), illetve M9 táptalajon (3. oszlop) tenyésztett Escherichia coli 294 tenyészetből kinyert sejtfehérje szegregációja látható. A 4. és 5. oszlop a pTha7A2 plazmiddal átalakított hasonló sejtekből kapott sejtfehérje szegregációját mutatja. A pTha7A2 plazmid timozint kifejező plazmid, amelyet lényegében a már leírt módon állítottunk elő a pThal plazmidból kiindulva [lásd a timozin alfa 1 előállítására vonatkozó, fentebb idézett 035 454 sz. közzétett európai szabadalmi bejelentést]. A 4. oszlop LB táptalajon, az 5. oszlop pedig M9 táptalajon tenyésztett Escherichia coli 294 sejtek fehérjéjének szegregációjára vonatkozik. A 6. oszlop, ugyancsak összehasonlítás céljára, az LB táptalajon tenyésztett, pBR 322 plazmidot tartalmazó Escherichia coli 294 sejtek által termelt fehérje szegregációja. A kontroll fehérjékkel való összehasonlítás azt mutatja, hogy a 3. és 5. oszlopban a két legkiemelkedőbb sáv közül a legfelsőbb olyan méretű fehérje, amely D' polipeptidet és szomatosztatint, illetve timozint tartalmazó fúziós fehérje képződésekor várható (a másik kiemelkedő sáv a csillapító kiiktatása folytán képződő LE' polipeptidnek felel meg). A 3. ábra megerősíti azt, hogy triptofánban gazdag táptalajon a képződés visszatartott, ez a gátlás azonban megszűnik triptofán-hiányos körülmények között. D) Hasítás brómciánnal és a hormon termék radioimmun-vizsgálata Mind a timozint, mind pedig a szomatosztatint tartalmazó anyagnál a sejtfehérje teljes mennyiségét brómciánnal elhasítottuk, a terméket kinyertük, szárítás után puffer-oldatban szuszpendáltuk ésradioimmun-vizsgálattal analizáltuk. Ily módon igazoltuk a szomatosztatinnal, illetve timozinnal immunológiailag azonos termék képződését. A brómeiános hasítást a következő irodalmi hely ismerteti: D. V. Gocddel és munkatársai, Proc. Nat. Acad. Sei. USA. 76, 106 -110(1979). II. Heterológ géneknek a trp promotor-operátor rendszer irányítása alatti közvetlen kifejezésére szolgáló plazmidok kialakítása A gének közvetlen irányítására irányuló törekvés maga után vonta olyan plazmid létrehozását, amely egyetlen restrikciós helyet tartalmaz távol a trp operon összes szabályozó elemétől. Ehhez a restrikciós helyhez heterológ gének klónozhatok a trp vezető szekvencia helyett. Az alábbiakban az emberi növekedési hormon előállításával kapcsolatban mutatjuk be ezt a módszert. 10 pg pSom7A2 plazmidot EcoRI-vel hasítottunk és a triptofán genetikai elemeket tartalmazó, a 4. ábrán (5) jelzésű DNS-töredéket poliakrilamidgél-elektroforézissel. és elektroclúcióval elkülönítettük. 2 pg kapott DNS töredéket 10 percig 37 °C-on kezeltünk 2 egység Taq I restrikciós endonukleázzal úgy, hogy minden egyes molekulában a jelenlévő, közelítőleg öt Taq I hasítási hely közül átlagosan egynél következett be hasítás. Ezt a részlegesen feltárt elegyet poliakrilamidgél-elektroforézissel választottuk szét, és mintegy 300 bázispár részt -(12) jelzésű a 4. ábrán - különitettünk el eiektroelúcióval. A bázispár részek egy EcoRI végződést, és egy Taq 1 végződést tartalmaztak, A megfelelő Taq I hely az „átírás-beindítási hely” és a „lefordítás-beindítási hely” között helyezkedett el, és 5 nukleotid távolságra volt a trp vezető peptid ATG kódonjától. A 4. ábra mutatja be a DNS szekvenciát ennél a helynél. A leírt módon eljárva olyan töredéket tudtunk elkülöníteni, amely a trp operon valamennyi szabályozó elemét, azaz a promotor-operátor rendszert, az átírást kiváltó jelet, és a trp vezető riboszóma kapcsolódási helyét tartalmazta. A kapott töredékek 3' végénél, a trp vezető szekvenciára vonatkozó lefordítást beindító jel szomszédságában lévő Taq I maradékot ezután Xbal hellyé alakítottuk, az 5. ábrán látható módon. Ezt úgy végeztük el, hogy a fentebb nyert (12) jelzésű töredéket hozzákapcsoltuk egy olyan plazmidhoz, amely egyetlen EcoRI helyet és egyetlen Xbal helyet tartalmazott. Erre a célra lényegében minden olyan plazmid felhasználható, amely sorrendben a következőket tartalmazza: replikon, kiválasztható jellemző - például antibiotikummal szembeni ellenállóképesség —, továbbá EcoRI, Xbal és BamHI hely. Például egy Xbal helyet bevihetünk a pBR322 plazmid EcoRI és BamHI helyei közé [F. Bolivar és munkatársai. Gene, 2, 95-119 (1977)] például olymódon, hogy hasítást végzünk a plazmid egyetlen Hind III helyénél Hind III segítségével, majd a képződő „tapadós" végeket egyágra specifikus nukleázzal kezeljük, és a „tompa” véget összekapcsoljuk egy olyan szintetikus kétágú nukleotiddal, amely a felismerési helyet (például CCTCTAGAGG) tartalmazza. Úgy is eljárhatunk, hogy természetes eredetű DNS töredékeket alkalmazunk — mint ebben az esetben is — amelyek egyetlen Xbal helyet tartalmaznak az EcoRI és BamHI hasítási maradékok között. így a hepatitisz B vírus genomjának EcoRI és BamHI feltárási termékét 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 8
