195534. lajstromszámú szabadalom • Eljárás polipeptid előállítására bakteriális úton, triptofán promotor-operátor alkalmazásával
1 195 534 2 A fúziós fehérje termék all. ábra 6. oszlopában látható, leginkább elkülönülő sáv, amellyel részletesebben a VI. részben foglalkozunk. V. A trp LE' polipeptid fúziókat kifejező rendszer létrehozása, ahol a tetraciklinnel szembeni rezisztenciát a triptofán promotor-operátor szabályozza Egy olyan expresszió-hordozó létrehozására alkalmazott módszer, amely közeg képes sokféle heterológ polipeptid gén befogadására abból a célból, hogy trp LE' fúziós fehérjéket hozzon létre a triptofán operon irányításával, a következő jellemzőkkel rendelkező plazmid kialakítását vonta magával: 1) Tetraciklinnel szembeni rezisztencia, amely megszűnik, ha az ezt a rezisztenciát biztosító géneket szabályozó promotor-operátor rendszert lehasítjuk. 2) A tetraciklinnel szembeni rezisztenciát szabályozó promotor-operátor rendszer eltávolítása és összekapcsolása egy heterológ génnel és egy megfelelő fázisban elhelyezkedő triptofán promotor-operátor rendszerrel. Ily módon helyreáll a tetraciklinnel szembeni rezisztencia és lehetővé válik a heterológ génbetétet tartalmazó plazmidok azonosítása. Röviden és a tervezett beillesztések típusának megfelelően az volt a cél, hogy kialakítsunk egy olyan lineáris DNS szakaszt, amely Pst maradékkal rendelkezik a 3' végénél és Bgl II maradékot tartalmaz az 5' végénél, és egy olyan génhez kapcsoljuk, amely képes a tetraciklinnel szembeni rezisztencia biztosítására a promotoroperátor rendszer irányításával. Így, amint azt a 13. ábra is szemlélteti, a következőképpen jártunk el. A pBR322 plazmidot Hind III enzimmel hasítottuk, a túlnyúló Hind III végeket pedig SÍ nukleázzal távolítottuk el. Az SÍ nukleázzal végzett kezelés során 10pg, Hind 111 enzimmel hasított pBR322 plazmidot 30 jul SÍ pufferoldatban (0,3 M nátriumklorid, 1 mM cinkklorid, 25 mM nátriumacetát, pH = 4,5) 30 percig reagáltattunk 15 °C- on 300 egység SÍ nukleázzal. A reakciót 1 /il 30XS1 nukleáz megállító oldattal (0,8 M trisz bázis 50 mM etilén-diamino-tetraecetsav) állítottuk meg. Az elegyet fenollal extraháltuk, kloroformmal extraháltuk és etanollal kicsaptuk. Ezután EcoRI enzimmel feltárást végeztünk a korábban ismertetett módon. így poliakrilamidgélelektroforézissel és elektroelúcióval a (46) nagy töredékhez jutottunk. A kapott töredéknek van egy első, EcoRI „tapadós” vége és egy második, „tompa” vége, amelynek a kódolt ága a timidin nukleotiddal kezdődik. Amint azt a későbbiek során kimutatjuk, az Sl-gyel feltárt Hind III maradék, amely timidinnel kezdődik, hozzákapcsolható egy Klenow polimeráz I enzimmel kezelt Bgl II maradékhoz, és így helyreáll összekapcsoláskor a Bgl II restrikciós hely. A fenti I, részben ismertetett módon előállított pSom7 A2 plazmidot Bgl II enzimmel hasítottuk, a képződött Bgl II „tapadós” végeket kétágúvá alakítottuk a Klenow polimeráz I enzimes eljárással, mind a négy dezoxinukleotid trifoszfát alkalmazásával. A kapott termék EcoRI hasítása, ipajd a (42) kis töredék poliakrilanüdgél-elektroforézise és elektroelúciója olyan lineáris DNS darabot eredményezett, amely a triptofán promotor-operátort és a Bgl II hely utáni „közeli” LE' szekvencia kódonjait („LE' (p)”) tartalmazta. A terméknek volt egy EcoRI vége és egy „tompa” vége a Bgl II hely kitöltése következtében. A Bgl II helyet azonban helyreállítottuk a (42) töredék „tompa” végének és a (46) töredék „tompa” végének összekapcsolásával. A két töredéket T4 DNS ligáz jelenlétében kapcsoltuk össze, és a kapott pHKY 10 plazmidot (lásd a 13. ábrát) megfelelő Escherichia coli 294 törzs sejtjeibe történő átvitellel megsokszoroztuk. A tetraciklinnel szemben rezisztens, a rekombinált pHKY 10 plazmidot hordozó sejteket tenyésztettünk, a plazmid DNS-ét extraháltuk, Bgl II és Pst enzimmel kezeltük, majd poliakrilainidgél-elektroforézissel, és elektroelúcióval elkülönítettük a nagy töredéket, amely Pst és Bgl II „tapadós” végeket tartalmazó lineáris DNS darab. Ez a (49) DNS töredék tartalmazza areplikációs eredetét, és értékesnek bizonyult első komponensként olyan plazmidok kialakításánál, amelyeknél a trp promotor-operátor szabályozza mind a trp LE polipeptiddel összekapcsolt fehérjéket kódoló géneket, mind a tetraciklinnel szembeni rezisztenciát szabályozó gént. A IV. részben leírt módon előállított pSom7 A2A4 plazmidból előállítható egy olyan rendszer második komponense, amely képes sokféle heterológ szerkezeti gén befogadására. Amint a 12. ábrán látható, a plazmidot részleges EcoRI hasításnak (lásd a IV. részt), majd Pst hasításnak vetettük alá, s poliakrilamidgél-elektroforézissel, és azt követő elektroelúcióval elkülönítettük a trp promotoroperátort tartalmazó (51) töredéket. Az EcoRI enzimmel végzett részleges feltárással kapott* töredéket elhasítottuk a szomatosztatin gén 5' vége szomszédságában, nem hasítottuk azonban el az ampicillinnel szembeni rezisztenciát biztosító gén és a trp promotor-operátor között jelenlévő EcoRI helynél. Az ampicillinnel szembeni rezisztencia, amely megszűnt az apR génben Pst enzimmel végrehajtott elvágás következtében, helyreállítható az (51) töredékkel történő összekapcsolással. A harmadik komponenst, a timozin alfa 1-re vonatkozó szerkezeti gént, a pThAl plazmid EcoRI és BamHI enzimekkel végzett feltárásával állítottuk elő. Az (52) töredéket poliakrilamidgél-elektroforézissel és elektroclúcióval tisztítottuk. Ezután összekapcsolhattuk a (49), (51) és (52) géntöredéket, a megfelelő orientáció biztosításával, a 12. ábrán vázolt módon. A kapott pTha7AlA4 plazmidot az ampicillinnel és tetraciklinnel szembeni rezisztencia alapján lehetett azonosítani. Az Escherichia coli 294 törzsbe transzformált plazmid az I. részben ismertetett tenyésztési körülmények között egy trp LE' polipeptiddel összekapcsolt fehérjét termelt, amelyből brómeiános kezeléssel timozin alfa 1-t lehetett specifikus módon lehasítani. Amikor EcoRI és BamHI végződésekkel ellátott, más heterológ szerkezeti géneket kapcsoltunk össze hasonló módon a pHKY 10 plazmidból és a pSom7 A2A4 plazmidból származó komponensekkel, ugyancsak hatékonyan képződtek olyan, a trp LE' polipeptiddei összekapcsolt fehérjék, amelyeket ezek a heterológ gének kódoltak. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 12
