195534. lajstromszámú szabadalom • Eljárás polipeptid előállítására bakteriális úton, triptofán promotor-operátor alkalmazásával
1 I <>5 534 All. ábra plazmiddal transzformált Escherichia coli 294 törzs összes sejtfehérjéjének nátrium-dodecil-szulfátos poliakrilamidgél-elektroforézisscl történő' szétválasztását szemlélteti. Mindegyik esetben a legsötétebb sáv annak az összekapcsolt fehérje terméknek felel meg, amely a triptofán promotor-operátor rendszer irányításával képződött. All. ábrán az 1. oszlop Escherichia coli 294/pBR322 törzsből származó összes sejtfehérje szétválasztásának megfelelő kontroll. A 2. oszlop a IV. rész szerint előállított pSom7 A2A4 plazmidból származó, s/.omatosztatinnal összekapcsolt terméknek felel meg. A 3. oszlop a pSom7 A1A4 plazmid szomatosztatin-tartalmú kifejezési terméke. A 4. oszlop a pTha7AlA4 plazmid kifejezési termékét tartalmazza, míg az 5. oszlop egy következőképpen nyert plazmidból kifejezett terméket tartalmaz: a fentebb tárgyalt pHKY 10 eredetű és pSom7 A2A4 eredetű töredéket összekapcsoltunk egy EcoRI/BamHI végű szerkezeti génnel, amely az emberi proinzulint kódolja. A 6. illetve 7. oszlop a legsötétebb sávként egy, a trp LE' polipeptiddel összekapcsolt fehérjét tartalmaz, amelyből lehasítható az emberi inzulin B és A lánca. Az inzulin B és A szerkezeti géneket a plBl illetve pl A11 plazmid EcoRl és BamllI enzimekkel történő feltárásával kaptuk [a szerkezetet illetően lásd D. V. Goeddel és munkatársai, Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 76, 106 (1979)]. A 8. oszlop méretjelzőket tartalmaz, a korábban leírtak szerint. Jóllehet a találmány szerinti eljárás előnyös változatát az Escherichia coli baktériumtörzsekkel kapcsolatban írtuk lc,*más enterobacteriaccae fajták is hasonlóan felhasználhatók „gazdasejtként” a polipeptidek előállításához és trp operon forrásként; így megemlítjük például a Salmonella typhimurium és Serratia marcesans törzseket. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás polipeptid-termék előállítására az adott peptidet kódoló szerkezeti gént tartalmazó replikálható plazmid-jellegű expresszió-hordozóval transzformált baktériumokban, azzal jellemezve, hogy I) baktériumokat egy olyan replikálható expresszióhordozóval transzformálunk, amely a kódoló szál első 5'-végétől egy második 3'-végéig azonos fázisban a következő elemeket tartalmazza: 1. egy baklcriális trp promotor-operátor rendszert; 2. az alábbi 4. elem fordítását kiváltó riboszóma kötési helyet kódoló nukleotidokat; 3. a 4. elem fordítását beindító jeletkódoló nukleotidokat; 4. az adott heterológ polipeptid aininosav-szckvcnciáját kódoló szerkezeti gént; mimcllctt az. említett szekvencia nem tartalmaz sem trp legyengítő képességet, sem a trp E riboszóma kötési helyet kódoló nukleotidokat; II) az így transzformált bakteriális inokulomot (oltóanyagot) fermentációs edénybe helyezzük, és egy előre meghatározott szintig — amely alacsonyabb a stacioner szaporodási fázis szintjénél — szaporítjuk egy olyan alkalmas tápközegben, amely az említett promotor-operátor rendszer repressziójára elegendő mennyiségű triptofán adalékot tartalmaz; és III) az említett triptofán adalékot megvonjuk a baktériumoktól, és ezzel a repressziót megszüntetjük, és lehetővé tesszük a szerkezeti gén által kódolt termék expresszióját. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy oltóanyagként, egy teljesen heterológ polipeptid aniinosav-szekvcnciáját kódoló szerkezeti gént tartalmazó hordozóval transzformált bakteriális oltóanyagot alkalmazunk. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy oltóanyagként egy heterológ polipeptidet és valamely homológ polipeptid legalább egy részét tartalmazó fúziós fehérje aminosav-szckvenciáját kódoló szerkezeti gént tartalmazó hordozóval transzformált bakteriális oltóanyagot alkalmazunk. ; 4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hegy oltóanyagként olyan szerkezeti gént tartalmazó hordozóval transzformált bakteriális oltóanyagot alkalmazunk, amely a fúziós fehérje homológ polipeptidjeként a korizminsav-lriplofán bioszintézisben résztvevő valamely enzim aminosav-szckvcnciájának egy részét kódolja. 5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy oltóanyagként olyan szerkezeti gént tartalmazó hordozóval transzformált bakteriális oltóanyagot alkalmazunk, amely egy heterológ polipeptidként valamely bioaktív polipeptidet, hozzákapcsolt homológ polipeptidként pedig egy a homológ polipeptidről specifikusan lehasítható, bioinaktiváló polipeptid aminosavszekvenciáját tartalmazó fúziós fehérjét kódol. 6. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy oltóanyagként olyan szerkezeti gént tartalmazó hordozóval transzformált bakteriális oltóanyagot alkalmazunk, amely a fúziós fehérje homológ polipeptidjeként triptofán E polipeptid aminosav-szekvenciáját kódolja. 7. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy oltóanyagként olyan szerkezeti gént tartalmazó hordozóval transzformált bakteriális oltóanyagot alkalmazunk, amely az összekapcsolt fehérje homológ polipeptidjeként a triptofán D polipeptid aminosav-szekvenciáját kódolja. 8. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy oltóanyagként olyan szerkezeti gént tartalmazó hordozóval transzformált bakteriális oltóanyagot alkalmazunk, amely az összekapcsolt fehérje homológ polipeptidjeként a triptofán vezető polipeptid első hat an inosavját és a triptofán E polipeptid gén utolsó harmada által kódolt aminosav-szekvenciát kódolja. 9. Az 1. igénypont szerinti eljárás III) lépése, azzal jellemezve, hogy a triptofán adalékanyagnak a baktériumokból történő megvonását a triptofán-adagolás megszüntetésével és a fermentációs táptalaj hígításával végezzük. 10. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy bakteriális gazdasejtként Escherichia coli baktériumokat alkalmazunk. 11. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 13
