195533. lajstromszámú szabadalom • Eljárás génsebészeti úton módosított mikroorganizmusok előállítására amiláz előállítás céljára
1 195 533 2 Ac. Sei. 74, 3259-3263 (1977) módszerével. Ebben a keverékben bármely olyan dezoxi-ribonukleinsav molekula, amely a lambda-dezoxi-ribonukleinsav cos extremitásait tartalmazza, és megfelelő nagyságú, beépül a fágfehéijébe, ily módon in vitro olyan biológiailag aktiv fágrészecskékbez jutunk, amelyek képesek fertőzni az E. coli sejteket, és infckciós központokat (plakk) produkálnak. Az eljárás hatékonyságát két kontrollal vizsgáljuk. Ezek a következők: 1) A keverék egy mintáját E. coli sejtekre szélesztjük, a bevitt lambda-dezoxi-ribonukleinsav jug-jára számítva 3X105 plakkot kapunk. Ez körülbelül 100-szor több, mint amit a hasított készítménnyel kapunk, ez a ligázos kezelés jó hatékonyságát jelzi. 2) A kapott plakkokat vizuálisan vizsgáljuk. A plakkok 70%-a nem homályos, hanem tiszta; ez a B. megatérium dezoxi-ribonukleinsav fragmenseinek jelenlétére utal, azaz új szakasz lépett be, aminek következményeként inaktiválódik a lambda Cl génje, amely a plakkok zavarosságáért tehető felelőssé. Bizonyított tehát, hogy a készítmény olyan NM 590 lambda-fág dezoxi-ribonukleinsavat tartalmaz, amely magában foglalja a Hind 111 által hasított összes. B. megaterium dezoxi-ribonukleinsav fragmenseket. B) A lambda-fág- B. megaterium amiláz gént hordozó származékainak izolálása Az enkapszidációs elegy megmaradt részével nagyszámú, keményítőt tartalmazó, E. colival fertőzött lemezeket oltunk, lemezenként 103 élő részecskét használva. Növesztjük a fertőzött E. coli-t, létrejönnek a plakkok, majd ezt követően a keményítőt lebontó plakkok jelenlétét vizsgáljuk. Ezt oly módon végezzük, hogy a lemezeket jódgőzök hatásának tesszük ki rövid időn át. Azt várjuk, hogy a fenti fágok által létrehozott plakkok körül átlátszó zóna van, amely abból adódik, hogy a lízist szenvedett sejtekből származó amiláz kidiffundál és hat. Egy ilyen plakkot találtunk, az itt jelenlévő fágokat izoláljuk, és tenyésztjük (hosszabb jódkezelés elpusztíthatja a fágokat). A plakkból származó utódok amilázt termelnek, a fágot lambda NM 590 Amy 1-nek neveztük el. A lambda NM590 Amy 1 fágot 1980. február 12-én NCIB 11569 sorszámmal letétbe helyeztük az NCIB törzsgyűjteményébe. C) Az amiláz kén újraklórozása a pBR 322 plazmidba * 1 A kísérleteket abból a célból végezzük, hogy amilázt túltermelő törzset kapjunk, és hogy amilázt tartalmazó nagymennyiségű dezoxi-ribonukleinsavat izolálhassunk. A lambda NM 590 Amy 1 dezoxi-ribonukleinsavának 1 /ug-ját és 0,3 ßg pBR 322 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat Eco RI-vel hasítunk, az elegyeket keverjük, ésligázzal inkubáljuk az A) részben megadottak szerint. A készítményt ismert módszereket használva a HB 101 törzs transzformálására használjuk fel. A szelekciót az ampicillin (ap) rezisztencia alapján végezzük, a plazmid jelenlétét ugyanis ez jellemzi. A plazmid közönséges körülmények között tetraciklinncl szembeni rezisztenciát is biztosít (Te). Az idegen dezoxi-ribonukleinsav bevezetése ebbe a plazmidba azonban hasítja a tét gént, ily módon a tetraciklinre érzékeny transzformált kiónok klónozott dezoxi-ribonukleinsavat hordozó plazmidot tartalmaznak. Esetünkben a kiónok 16%-a új plazmidot tartalmaz, ez az E. coli sejtekben amiláz aktivitást biztosít. (A jelenlegi nemzetközi nómenklatúra szerint az új plazmidot pCP-nek neveztük el, a jelen példában kapott plazmidot pedig pCP 1-nek). A fentiek azt jelzik, hogy egy gén újraklónozása hasonló enzimmel (esetünkben a Hind III enzimmel) igen hatékony folyamat (16% 1/105 helyett). A plazmidot tartalmazó mikroorganizmust E. coli CL 7001 (pCP 1) jellel jelöljük, és 1980. február 12-én NCIB 11570 sorszámmal letétbe helyeztük az NCIB törzsgyűjteményébe. D) Az enzimtermelés erősítése A pCP 1 plazmidot uirtalmazó sejtek enzimtermelését az alábbi két módon fokozzuk: 1) Telített tenyészetek A sejteket 37 °C hőmérsékleten, 5 liter térfogatú Erlenmeycr-iombikbnn inkubáljuk egy éjszákán át, a lombik egy liter táptalajt tartalmaz (LB; élesztőkivonattripton). 2) Kloramfenikolos erősítés Egy liter térfogatú táptalajt (LB) öntünk 5 liter térfogatú Erlenmeyer-lombikba, a tenyészetet 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk körkörös kitérésű rázógépen mindaddig, míg a tenyészet sűrűsége 0,8 lesz (650 nm hullámhosszúságon mérve). Ekkor 150 ftg/ml kloramfenikolt adagolunk. Ez az antibiotikum meggátolja a kromoszomális dezoxi-ribonukleinsav további replikációját, azonban megengedi az amiláz gént meghatározó pCP 1 plazmidét. A plazmid sokszorozódását (3000 másolat) követően a kloramfenikolt eltávolítjuk, amikor lehetségessé válik a protein-szintézis. Úgy járunk el, hogy az amplifikálás után elkülönítjük a sejteket a táptalajból — például centrifugálással —, a kloramfenikol eltávolítására mossuk, és az amiláz-termelésre tenyésztjük, E) Enzim kinyerés Az igen tiszta a-amiláz elkülönítésére az úgynevezett ozmotikus sokk módszert használjuk. A módszert Neu és Heppel írja íe [J. Biol. Chem. 240, 3685—3692. (1965)]. A módszer az alábbi: A sejteket egy éjszakán át tenyésztjük, a tenyésztést követően 25% szaccharózt tartalmazó oldatban szuszpendáljuk őket, a szaccharózos oldat térfogata a tenyészlé térfogatának fele. 10 percen át 24 °C hőmérsékleten rázzuk a szuszpenziót, amikor a sejtek plazmolízise bekövetkezik. Ezután 1 mmól végkoncentrációban EDTA-t adagolunk (a sejtfal permeabilitásának növelésére), és további 10 percen át rázzuk a szuszpenziőt, 24 °C hőmérsékleten. Ezután centrifugáljuk, és a sejteket gyorsan 0 °C hőmérsékletű vízben szuszpendáljuk, és ezen a hőmérsékleten rázzuk 10 percen át. Ismét centrifugáljuk a szuszpenziót, amiután az enzim 96%-a elkülöníthető a felülúszóból. összehasonlítás miatt n donor mikroorganizmust 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
